世界防治结核病日——这些结核分子诊断方法你需要知道！

1882年3月24日是著名德国科学家罗伯特·科赫在柏林宣读发现结核菌的日子。在1982年纪念科赫发现结核菌100周年时，世界卫生组织(WHO)和国际防痨和肺病联合会(IUATLD)共同倡议将3月24日作为“世界防治结核病日”，以提醒公众加深对结核病的认识。2021年3月24日是第26个世界防治结核病日，今年我国的宣传主题是：“终结结核流行，自由健康呼吸”

结核病(Tuberculosis，TB)是常见并可致命的一种传染病，由结核分枝杆菌感染引起，主要通过空气传播。结核病困扰人类已经有成千上万年的历史。科学家们在9000年前的以色列人遗骸和2000年前的埃及木乃伊上都发现了肺结核感染的痕迹。如今，这种病每年仍导致大概150万人死亡，多于其他任何一种传染病，是目前全球面临的重大公共卫生问题之一。

2020年10月14日，世界卫生组织（WHO）正式发布了最新的全球结核病年度报告。报告估计过去一年全球新发结核病患者仍有1000万，其中32%为女性，12%为15岁以下儿童，全球因结核死亡患者约141万。大多数结核病病例集中在东南亚（44%）、非洲（25%）和西太平洋（18%），而东地中海（8.2%）、美洲（2.9%）和欧洲（2.5%）占比较小；三分之二的结核患者来自8个国家：印度（26%）、印度尼西亚（8.5%）、中国（8.4%）、菲律宾（6.0%）、巴基斯坦（5.7%）、尼日利亚（4.4%）、孟加拉国（3.6%）和南非（3.6%）。中国新发患者数约83.3万，居全球第三位，仅次于印度和印度尼西亚。防治肺结核的工作依旧严峻。

早期快速确诊及治疗是控制结核病传播的关键，目前肺结核的诊断主要依靠患者症状、胸部影像学检查及痰涂片抗酸染色和痰MTB培养。然而，肺结核患者症状及影像学检查往往缺乏特异性，痰涂片抗酸染色法检查敏感性和特异性都很低，很多时候会导致漏诊；痰MTB培养耗时长，以上检测手段难以满足早期快速诊断肺结核的要求。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子诊断方法被应用于结核病临床诊断。2017 年我国颁布的《“十三五”全国结核病防治规划》中明确提出分子生物学检验阳性可以辅助确诊肺结核。

分子生物学诊断

结核病分子生物学诊断方法主要分为：

①实时荧光定量PCR 检测

②恒温扩增检测

③基因探针（基因芯片）检测

实时荧光定量PCR

通过监测荧光信号实时检测结核菌的特异基因及耐药相关基因 单核苷酸多态性（SNP） 位点，可以在 2 小时内检测样本中是否存在结核分枝杆菌以及是否耐药，是目前最快的结核病分子诊断技术之一，并且该方法操作简便、检测准确性高（敏感度 88％，特异度 99％）、污染几率小，不足之处是价格昂贵，并且目前仅能针对利福平耐药相关 rpoB 做出检测，能够检测的耐药相关基因及位点较少。2010年12月WHO批准了利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术( Xpert MTB /RIF)的应用，该技术被WHO誉为结核病诊断中革命性的突破。

恒温扩增

利用链置换型 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下对目标基因进行快速扩增反应。该方法可用于涂阴结核病的诊断，检测灵敏度在 50％～80％之间，并且恒温诊断方法对仪器的依赖程度小，试剂成本低，非常适用于基层结核病的检测，代表方法：loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP; Eiken Chemical, Tokyo, Japan)。但是该方法容易产生假阳性结果，实验室检测时需要注意分子气溶胶的产生。

基因探针（基因芯片）检测

分为扩增和检测两步，首先对特异的片段进行 PCR 扩增，然后检测扩增后片段是否与结核分枝杆菌（MTB）检测探针或者耐药检测探针结合。其特点是可以区分结核病与非结核病，检测通量高，并且可以在 5～8 小时内检测是否为耐多药结核病（MDR-TB），代表方法： line-probe assays (LPAs; GenoType® MTBDRplus and GenoType® MTBDRsl, HAIN Lifescience, Nehren, Germany; NTM+MDRTB Detection Kit, NIPRO Corporation, Osaka, Japan)，该方法特异度及灵敏度较高（80％～90％）。其缺点是需要开盖操作，容易产生污染，并且操作繁琐，价格昂贵。

未来展望

过去几十年，为预防和治疗结核病及耐药性结核病，全球进行了大量努力。结核病的基础研究、诊断方法和治疗手段都取得了巨大进步。通过此次新冠疫情我们也认识到分子诊断技术推广的必要性，随着人工智能和实验室自动化技术的快速发展，全面实现肺结核自动化分子诊断将是未来的一大趋势。

参考文献：

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