大规模寡核苷酸合成案例分享

发布时间： 2023-08-28 13:13 来源：苏州英赛斯智能科技有限公司

领域：	生物制药/仿制药,疫苗,抗体药物,核酸药物,细胞治疗,制药工艺
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2020年mRNA疫苗的成功，让核酸药物成为整个制药行业炙手可热的赛道。也让同属于核酸药物的小核酸药物引起了广泛关注。其实早在1998年，就已经有小核酸药物上市。至今共15款小核酸药物获得FDA批准（其中2款ASO药物和1款适配体药物由于销售额过低等原因退市）。据统计，自2016年到2021年全球小核酸药物市场规模从0.1亿美元已增长至32.5亿美元，年复合增长率达217.8%。展示出巨大的增长潜力。

虽然同属于核酸药物，mRNA和小核酸药物的生产工艺大不相同。mRNA通常分子量较大，达上千nt，目前多采用以线性化质粒为模板进行体外转录（IVT）制备。而小核酸药物主要包括反义寡核苷酸 (ASO)、小干扰RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、小激活RNA (saRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA适配 (Aptamer)，一般小于100nt，通常在20-30nt，目前制备工艺仍以固相合成工艺为主。

寡核苷酸合成是一个多步连续的反应，一个循环主要包括Detritylation（脱DMT），Coupling （偶联），Oxidation（氧化，O或S），Capping（封闭）四步反应，每个循环增加一个核苷酸单体，要求反应过程中的副反应尽可能少，否则目标产品的产率就可能很低，且纯化的难度会非常大。所以每一循环的合成效率和循环数（单体数）也就直接决定了最终产品的纯度和产率。

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图 1 寡核苷酸合成过程——示一个循环

比如，同样合成30个碱基的寡核苷酸，在每步合成效率为99.0%时，最终计算产率为74.72%；而如果单步收率降低至98.0%, 则最终收率会降低至55.66%。而同样单步合成效率为99.0%时，10个单体的寡核苷酸产率可达91.35%，而100个单体的寡核苷酸只能获得36.97%。所以固相合成工艺一般合成都在100个单体以内，超过60个单体已经是比较有挑战的了。

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图 2 寡核苷酸单步偶联效率和最终收率计算

寡核苷酸固相合成的关键，包括所用试剂和单体的质量、合成工艺参数，也与所用设备息息相关。在核酸药物发展初期，英赛斯就敏锐的发现了相关市场对大规模核酸合成仪的需求，基于自有专利柱塞泵技术和对寡核酸合成工艺的研究，于2021年9月推出了Unique AutoOligo系列，目前产品已涵盖AutoOligo25，AutoOligo100，AutoOligo150，以及中试规模的AutoOligo600。制备量从10μmol 到50mmol。

产品上市后已广泛应用于DNA，RNA以及各种修饰寡核酸的合成，并成功应用于长达85个碱基的寡核苷酸合成。

案例分享：

案例1：21碱基甲氧氟代RNA合成，高合成效率，高纯度

序列：RNA 21碱基甲氧氟代

目标分子量：6596.3

合成仪器：AutoOligo600

合成柱：FineLINE 35 24ml
载体信息：Nitto Phase^® HL UnyLinker^TM250

合成规模：0.660mmol

单次偶联效率：99.5%

合成纯度：91.268%

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