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修饰蛋白质组学

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参考报价: 面议 型号: 修饰蛋白质组学
品牌: 欧米克斯 产地: 上海
关注度: 3 信息完整度:
样本: 暂无样本 典型用户: 暂无

PTMs过程是蛋白质被正确表达、剪切、折叠后所经历的共价加工过程,而后才会成为具有相应生理功能的成熟蛋白。

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PTMs在多种细胞过程,如细胞分裂、蛋白分解、信号转导、调控过程、基因表达调控和蛋白相互作用中起到关键作用。这些修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和蛋白水解,并影响细胞正常状态及病理过程中的方方面面。

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PTM的种类非常繁多,真核生物体内存在300余种蛋白质翻译后修饰类型。修饰后的蛋白质固有含量非常低,且由于修饰基团的引入,蛋白质的电荷状态、亲疏水性等发生了改变,对检测灵敏度要求非常高。绝大多数修饰都必须经过富集才能够进行高通量检测。不同修饰类型的富集方法各不相同,目前我司专精于磷酸化与糖基化两种主要修饰的富集服务。

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磷酸化蛋白质组学

磷酸化修饰是发生最为广泛的共价修饰和最重要的调控修饰,该过程可逆,磷酸化/去磷酸化分别由激酶和磷酸酶催化,某一给定时刻,真核细胞中至少1/3以上蛋白质正在发生磷酸化修饰;主要的磷酸化类型:Ser (S) : Thr (T) : Tyr (Y) ≈ 1800 : 200 : 1。

磷酸化修饰与信号传导、细胞周期、生长发育、癌症发生发展等密切相关。

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  • 磷酸化蛋白质组学研究的技术挑战性

        磷酸化过程瞬时发生且可逆,对样品采集和保存的要求非常高。磷酸化蛋白质固有含量非常低,样品处理时采用高效的特异性富集手段非常必要,选择什么样的富集方法?如何判断富集效率、特异性、回收率?由于磷酸基团所引入的负电荷,修饰肽段更加难以离子化,磷酸化修饰和硫酸化修饰所产生的质量偏移非常接近  Phosphorylation 79.96633; Sulphation 79.95682。


  • 磷酸化蛋白质组富集策略

  1. 免疫亲和富集法:专一识别磷酸化氨基酸残基的高特异性抗体(沉淀法/色谱法)

  2. 固相金属亲和色谱法(IMAC):填料+螯合剂 (NTA/IDA/…)+金属离子 (Fe3+/Ga3+/Ti4+)

  3. 金属氧化物亲和色谱法(TiO2 /Al2O3/ZrO2/…)

  4. 预分离色谱法:强阳离子交换色谱 (SCX)、亲水性相互作用色谱 (HILIC)

  5. 化学衍生修饰法:β消除+生物素标记,碳二亚胺缩合法等。


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  • 定量磷酸化蛋白质组学实验操作注意事项

  1. 样本前处理:实验操作低于4°C进行;所有buffer务必加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂等

  2. 富集策略:免疫亲和富集、TiO2富集、IMAC富集 (Fe3+, Ti4+)、亲水相互作用色谱/强阳离子交换色谱预分离等

  3. 定量方法:TMT/iTRAQ标记定量、非标定量等

  4. 二级质谱碎裂模式:CID、HCD、ECD、ETD、EThcD


  • 基于生物大分子质谱的磷酸化蛋白质组研究

  1. 基质辅助激光解析质谱(MALDI-MS)

    磷酸酯酶处理:脱去带负电的磷酸基团,增强肽段质谱响应

    2,5-DHB基质 (含1%H3PO4):提高磷酸化肽段离子化效率,降低非磷酸化肽段的信号抑制

    改性MALDI靶板:TiO2修饰MALDI靶板,减少富集损失,尤其适用于痕量样品的质谱前处理

  2. 电喷雾质谱(ESI-MS)

    扫描模式的选择:前体离子扫描 (负离子模式PO3-;正离子模式 pTry immonium)

    碎裂方式的选择:CID/HCD/ECD/ETD/EThcD/…单一或者联合使用,获取更为丰富的碎片离子信息


  • 定量磷酸化蛋白质组学实验流程


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  • 技术优势:

1、通过高效富集,可以鉴定到大量修饰位点。

2、可与蛋白质组学、代谢组学进行多组学联合分析,阐述分子机制。

注:该仪器未取得中华人民共和国医疗器械注册证,不可用于临床诊断或治疗等相关用途

修饰蛋白质组学 - 应用文献

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