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蛋白质组学送样检测指导手册

发布时间: 2020-04-21 21:41 来源:昆山欧米克斯生物科技有限公司

下载地址:蛋白质组学送样检测指导手册


1. 样本准备基本原则

锚点代表性和一致性原则样本的取材部位、时间、处理过程等方面尽可能保持一致,否则可能会影响实验结果的可信度。准确的分离病变组织和对照组织。取样部位不一致和不具有代表性会影响结果。
锚点迅速性原则样本质量是影响实验结果的最主要因素,用于研究的样本,在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地快,最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。
锚点低温原则样本离体后,立即在4℃或冰上等低温条件下进行分离,分离好的样品立即置于液氮、干冰或-80℃冰箱中直至实验,以避免蛋白的降解。

2. 样本名称、包装、运送

样品名称最好采用双重标记以防样品名称模糊;建议使用进口离心管。标记1:用高质量的油性笔在样品管上写上清晰、简单的样品名称,最好5个字符以内(不要写中文),用封口膜封好。标记2:将样品名称等信息写在标签纸上,贴在管壁上,最好用胶带粘贴牢固以防低温条件下样品标签脱落。
样品包装按送样指导的要求准备样品,采用高质量离心管盛装样品。冷冻的组织,用高质量的2ml的螺旋冻存管装载;离心管应用封口膜密封管口。干冰运输,72小时内到达,15kg干冰即可。
邮寄样品邮寄样品请附带完整的样品信息说明。建议自己存好备份样品。如样品有生物危险请提前咨询技术人员。


3. 蛋白质组学不同类型样品的要求及准备                                                                                     

以下的送样量是常规蛋白质谱项目要求,做翻译后修饰的项目需要富集,起始量较大,磷酸化建议蛋白总量达到5mg以上,其他类型的修饰建议蛋白量达到20mg以上。                                                                                     

请提前联系技术支持,根据实际情况设计实验并准备样品的量。                                                                   


3.1 动物组织样本

样品类型推荐送样量预处理及保存
动物组织200mg-2g1) 最好使用进口品牌离心管或冻存管。2) 样品选取的部位要一致,去除非目标组织。3) 取材新鲜组织,用PBS 清洗组织表面,去除血渍;迅速除去组织表面的筋皮及脂肪组织,剪切成边长0.5cm小块或100mg左右小块,将组织块在盛有液氮的锡纸槽中速冻后,再装入液氮预冷的螺口冻存管中,将螺口盖子旋紧。4) 样品采集完成后,迅速进行液氮速冻5min以上,之后可转移至-80℃冰箱冻存,避免反复冻融。
动物坚韧组织-毛发100mg-2g依次用适量PBS或生理盐水,去除污染物,干燥,保存在-80℃。

3.2 植物组织样本

样品类型推荐送样量预处理及保存
嫩叶1g-5g1) 建议使用进口品牌离心管或冻存管或者采用干净的锡箔纸。2) 选取的部位要一致,去除非目标组织。3) 取材新鲜组织,尽可能的去掉状态不好的部分,保持样品的一致性。(样品离体前用PBS或生理盐水洗掉杂质吹干后,再采集样品。根等地下部分在样品离体后,预冷的PBS清洗污染物。)将样品剪切成小块,装入液氮预冷的离心管或冻存管中,盖紧盖子,液氮速冻5min以上。如用锡箔纸保存,锡箔纸的内、外壁均要明确标示样品名称,在液氮速冻5min以上。-80℃冰箱保存。
树根、树皮、树枝等8g-50g
果实、种子2g-5g
花粉200mg-400mg收集开花期花粉,显微镜用解剖针去除杂质,转入EP管内,-80°保存。
藻类组织800mg-2g采取合适的离心力分离藻类并保证细胞完整,如1000g离心15min,收集沉淀,并用PBS洗涤沉淀三次,分装样品,立即液氮速冻,-80℃保存。

3.3 微生物样本

样品类型推荐送样量预处理及保存
菌类100-300μl纯菌体1) 采用离心等方法分离菌和培养基,避免培养基蛋白对菌的污染。2) 收集菌体并用PBS(或其他符合要求的缓冲液)溶液洗三遍。3) PBS重悬菌体并转移至1.5ml离心管中,离心去上清,如果样品量比较多,最好分装,每管50μl左右,液氮速冻后,-80℃保存。

3.4 细胞

样品类型推荐送样量预处理及保存
细胞5×106个细胞/管2- 3管。或50μl细胞沉淀/管2-3管1) 悬浮细胞培养至细胞浓度为2-5×10⁵/ml;贴壁细胞在合适的培养基中培养至覆盖培养皿70-90%面积,去掉培养基并用PBS溶液清洗后用胰蛋白酶消化细胞收集。2) 400-1000g离心5-10分钟收集细胞并用PBS溶液洗三遍。3) 用PBS重悬细胞,转移至1.5ml离心管中, 400-1000g离心弃上清,不要残留过多的液体,每管细胞体积保持在50μl左右,送样2-3管。细胞液氮速冻后,-80℃保存。

3.5 液体

样品类型推荐送样量预处理及保存
血浆150μl *2管1) 采集血液样本,建议使用BD EDTA血常规管(含抗凝剂),有条件的话首选BD Vacutainer® 蛋白质组学产品BDTM P100组件或BDTM P800采血管(含抗凝剂和蛋白酶抑制剂)。2) 轻轻地180度上下颠倒混匀,持续8-10次,以混匀血液和添加剂。3) 立即4度,≤1300g(根据物种稍微进行调整)离心10min。4) 将血浆转移至离心管中,立即添加蛋白酶抑制剂(如有条件),混匀,瞬时离心。分装样品,每管150μl。-80℃保存。如没有潜在性危险,可以寄送样品;如有潜在性危险,请联系技术人员,根据实验目的,选择合适的灭活方法,自行灭活。
血清150μl *2管1) 收集全血至真空采血管(如BD vacutainer公司的红头真空采血管)。轻轻地180度上下颠倒混匀,持续5-6次。2) 4度放置30- 45min,  4度,≤1300g(根据物种稍微进行调整)离心10min。3) 将血清转移至离心管中,立即添加蛋白酶抑制剂(如有条件),混匀,瞬时离心。分装样品,每管150μl。-80℃保存。如没有潜在性危险,可以寄送样品;如有潜在性危险,请联系技术人员,根据实验目的,选择合适的灭活方法,自行灭活。
乳汁3ml*2管收集乳汁,用进口离心管分装,-80℃保存。酸沉法去除酪蛋白,用稀盐酸将溶液pH调至4.6,搅拌均匀,沉淀酪蛋白。
唾液0.5ml-5ml禁食两小时以上,9-12am取样,1000g-2000g离心或使用0.22um滤膜过滤收集唾液, 分装0.1~1ml*3管,-80℃保存。
泪液30μl-200μl收集样品(可利用capillary micropipette或Schirmer strip), 4℃,8000-14000g 离心取上清,-80℃保存。
尿液5mL*2~4管1) 收集不添加稳定剂的尿液样本,立即4℃,1500r/min 离心,去掉细胞和碎片,收集上清。2) 4℃,14000 rpm离心10分钟,去掉沉淀颗粒。上清转移至新的进口离心管并分装,5ml*4管,液氮或干冰速冻,- 80℃保存。
细胞培养上清液1ml*2管1) 细胞在合适的培养基中培养至覆盖培养皿70-90%面积。2) 去掉培养基后,用无血清培养基清洗三遍。加入无血清培养基,生长一定时间后,收集无血清培养上清于进口离心管中。3) 1000rpm离心10分钟去掉细胞,取上清,上清12000rpm左右高速离心去掉细胞碎片和沉淀,取上清并进行浓缩后分装到2个进口离心管中,每管的体积在1ml左右。-80℃冻存。(浓缩常用的方法是超滤,一般用3KDa的超滤管进行超滤浓缩)。
蛋白溶液/蛋白干粉蛋白总量500μg以上蛋白干粉低温冻干。提供蛋白提取方法及溶解缓冲液信息,如有定量请提供定量信息。可以用8M尿素含0.1-1%SDS裂解;其他溶解缓冲液可以使用纯水或PBS,如有其他buffer请提前咨询是否兼容,并填写到送样单上。

3.6 环境样本

样品类型推荐送样量预处理及保存
海底泥/污泥5g以上*3份样品分装成三管以上,-80℃冻存。

3.7 其他

样品类型推荐送样量预处理及保存
IP样品1管方法1:试剂盒法    使用Pierce MS-Compatible Magnetic IP Kit(protein A/G,ThermoFisher)试剂盒处理,洗脱体积不要太大。此方法后期可以溶液酶解。若后续进行label free定 量分析,推荐采用该洗脱方式处理。方法2:酸洗脱法,溶液配制: 0.1M Glycine溶液,Hcl调节pH至2.5。   取约40μl的0.1 M Glycine溶液加入离心收集到的琼脂糖珠-抗原抗体复合物中,孵育2h,离心收集上清。如果wash buffer中含有去垢剂,在elution之前必须用不含去垢 剂的wash buffer洗两遍,然后再做elution。洗脱体积不要太大。如果裂解液中含有Triton或者SDS,此方法得到的蛋白溶液后期需要丙酮沉淀后才可以溶液酶解,沉淀过程中会有一定的损失,建议优先选择方法1。方法3:蛋白结合在beads上面无法洗脱    将样品离心除去上清,将与beads结合的蛋白样品送样检测,但要注意实验过程中的试剂要与质谱兼容。注意事项:IP过程中使用的试剂不能含有NP40、Triton 、CHAPS,否则会影响样品的检测结果并对仪器有损害。另外,蛋白溶液样品寄送时需要备注buffer成分,否则无法安排后续实验。

注:                                                                           

1. 环境样品或者其他上述未提及的样本,请联系技术人员。

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