非洲猪瘟病毒检验方法

非洲猪瘟（African Swine fever；ASF），指由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus；ASFV）所引起的猪只高传染性及高致死性疾病，需以病毒分离或核酸检测定序方法进行非洲猪瘟病毒检测，其中以核酸检测方法是用于检出持续感染动物最敏感方法，亦为针对保存不佳检体的有效检测方法，常用检测方法有：
 

一、病毒抗原检测
 

血球吸附试验（Haemadsorption test）- 病毒分离（Virus isolation；VI）试验。

优点：
a, 特异性强：不与其它细胞因子反应。
b, 重复性好：板内、板间变异系数均小于 10%。
c, 稳定性高：实验效果很稳定。

缺点：
需要多次洗板，操作复杂，需要较多人力投入

二、病毒核酸检测（Detection of virus genome by the polymerase chain reaction）

（1）非洲猪瘟病毒定量聚合酶链反应（qPCR）试验。

市场上有很多非洲猪瘟荧光定量检测法的试剂盒，是针对非洲猪瘟病毒的高度保守区域设计特异性引物和探针，提取待测样本的基因组后进行 PCR 扩增，利用荧光定量 PCR 仪对 PCR 过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析（以上海某家公司的定量试剂盒为例）：

试剂盒有效性判定：

a, 阳性对照：有典型 S 型扩增曲线或 Ct 值 ≤ 35。

b, 阴性对照：Ct 值＞38 或无 Ct 值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

标本结果判定：

a, 阳性：标本检测结果 Ct 值 ≤ 35 或有明显指数增长期。

b, 可疑：标本检测结果 Ct 值在 35～38 范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果 Ct 值仍在 35～38 范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

c, 阴性：标本检测结果 Ct 值＞38 或无 Ct 值。

检验方法的局限性

当检测样本中被检核酸浓度低于试剂盒的最低检出限时可能会发生假阴性的结果。

（不同试剂盒，阳性判断的 ct 值可能会有所差异，根据具体试剂盒确定）

（2）非洲猪瘟病毒聚合酶链反应（PCR）试验。

PCR 法检测，体系配置简单快速，成本低。引物是根据保守的 vp73 基因设计，OIE（世界动物卫生组织）推荐。  市面上有多种厂家试剂盒可用，結果判读方法有：

①普通凝胶电泳

将电泳胶片置于 302 nm 波长之紫外光下观察分子标示物及 PCR 产物，并比较分子量大小。

②全自动毛细管电泳仪

毛细管电泳仪灵敏度高，可检测到单个 pg 级别的核酸浓度，并自动计算分子标示物及 PCR 产物大小。此方法是猪瘟病毒检测最简便的方法，如下图所示，

阴性（121bp 为 control 带）

阳性（121bp 为 control 带）

高敏度检测结果