必看 | 分子标记的发展与重生

分子标记属于遗传标记的一种。所谓遗传标记（genetic marker），是指可追踪染色体、染色体某一片段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。

遗传标记必须具有两个基本特征：可遗传性和可识别性。某种生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。

分子标记的概念

以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记。是 DNA 水平遗传多态性的直接反映，能直接反映生物个体或种群间基因组 DNA 间的差异。分子标记主要有以下优点：

（1）直接以 DNA 的形式表现，不受组织、发育阶段、季节、环境等因素的限制，不存在表达与否等问题，表现稳定；
（2）数量极多，遍布整个基因组；
（3）多态性高，自然界存在许多等位变异；
（4）许多标记表现为共显性的特点，能区别显性纯合体和杂合体，对隐性农艺性状的选择十分便利；
（5）表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；
（6）检测手段简单、迅速。



分子标记技术主要应用在如下几个方面：

（1）构建遗传连锁图谱；
（2）基因/QTL 定位；
（3）分子标记辅助选择育种；
（4）植物遗传多样性分析；
（5）品种和品质纯度鉴定及遗传纯度的测定；
（6）疾病检测。

分子标记的类型（发展）

分子标记的类型主要包括：第一代，基于分子杂交技术的分子标记技术（RFLP）；第二代， PCR 标记；第三代，SNP 标记。

1、第一代的 RFLP

第一代的 RFLP 标记目前已较少应用，RFLP 指的是限制性片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism）。由于植物基因组 DNA 上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失而产生限制性片段长度多态性。

RFLP 的原理是用限制性内切酶酶切不同个体的基因组 DNA，产生大小不等的 DNA 片段，通过电泳和 Southern 杂交转移到杂交膜上，利用同位素或非同位素标记的某一片段 DNA 作为探针，使酶切片段与探针杂交，从而显示与探针有同源序列的酶切片段在长度上的差异。

RFLP 反映了基因组 DNA 在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上差异，即反映了 DNA 分子水平上不同酶切位点的分布情况。



RFLP 标记的优点：大多为共显性；标记的重复性和稳定性好。

RFLP 标记的缺点：实验操作较复杂，检测周期长，成本高，不适于大规模的分子育种；检测中要利用放射性同位素，易造成污染；非放射性物质标记方法价格高，杂交信号较弱，灵敏度较低。

2、第二代 ：PCR 标记

第二代的 PCR 标记技术是目前应用最为广泛的分子标记技术。凡是基于 PCR 检测的多态标记（包括直接 PCR 和 PCR+酶切的方法）都属于 PCR 标记。主要包括 RAPD、SSR、STS、CAPS 和 dCAPS 等标记。

（1）RAPD 指的是随机扩增多态性标记（Random Amplified Polymorphism DNA）， 方法是用一种短的随机引物（一般 8-10bp）对基因组进行 PCR 扩增，当两个反向互补引物结合位点间距离满足 PCR 扩增条件，就可以产生扩增片段。当引物结合位点或结合位点间发生了插入、缺失或突变等变化， PCR 产物电泳结果就表现为带型增加或缺少，即产生 RAPD 标记。



RAPD 标记的优点：技术简单，检测速度快；DNA 需要量少，对 DNA 质量要求不高；一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组。
RAPD 标记的缺点：显性标记，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提供的信息量不完整。由于使用了较短的引物， RAPD 标记的 PCR 易受实验条件的影响，条带多，结果的重复性较差。

（2）SSR 标记指的是简单重复序列（Simple Sequence Repeat），SSR 也称微卫星 DNA（microsatellite DNA）或短串联重复（short tandem repeat，STR），是一类由几个（1~6 个）碱基为重复单位串联而成的 DNA 序列；常见的有 (TG)n、 (GA)n、(AAT)n 或 (GACA)n 等，植物基因组中以 (AT)n 最常见；这种基序广泛存在于真核生物及部分原核生物基因组中，随机分布在核 DNA、叶绿体 DNA 和线粒体 DNA 中；SSR 长度一般在 100bp 以内；SSR 的原理是微卫星 DNA 两侧多是高度保守的单拷贝序列，所以可根据两侧序列设计引物用于 PCR 扩增，再利用电泳检测 PCR 产物大小。SSR 高度多态性主要来源于核心序列串联重复数目不同。

SSR 标记的优点：共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；DNA 样品量少，对 DNA 质量要求不苛刻；重复性好，可靠性高；具有大量的等位差异，多态性十分丰富。

SSR 标记的缺点：必须知道重复基序两端的 DNA 序列的信息。如不能直接从 DNA 数据库查寻，则首先必须对其进行测序，再设计引物，开发成本高。

（3）AFLP 标记是指扩增限制性内切酶片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism），由于单核甘酸突变或插入/缺失突变等导致限制性酶切位点增加或减少，这种差异可通过选择性的 PCR 扩增来检测。AFLP 是在 RFLP 的基础上发展起来的，差别在于检测手段，AFLP 是揭示酶切位点和其后的选择性碱基变异的多态性。

AFLP 的原理是基于限制性酶切和 PCR 技术。通过对基因组 DNA 进行双酶切，产生大小不等的 DNA 片段，在酶切片段两端连接上人工接头，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1-3 个选择性碱基作引物对预扩增产物再进行选择性扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。



通常用一个四碱基识别位点的限制性内切酶（如 MseI）和一个六碱基识别位点的酶（如 EcoRI）；其中前者确保产生合适大小的 DNA 片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离，而后者能够限制扩增片段数目，确保 DNA 多态性的正常检测。接头序列包括一个核心序列和酶切位点特异序列，如 MseI 接头和 EcoRI 接头。

AFLP 标记的优点：具有 RFLP 技术的可靠性和 PCR 技术的高效性，可以在一个反应内检测大量限制性酶切片段，一次可获得 50～100 条谱带的信息； 显性（谱带有无）/共显性（插入或缺失导致的长度差异）；不需要标记开发成本，但是需要优化特异引物及引物组合；不需要基因组 DNA 序列信息；只需要很少量的 DNA。

AFLP 标记的缺点：对基因组 DNA 样品的质量要求高；多数情况下采用的是银染，相对比较费时耗财；在染色体上不均匀分布，AFLP 标记经常在着丝粒附近区域高度聚集。

3、第三代：SNP 标记

第三代 SNP 标记指单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism），即在基因组水平上由于单个核苷酸的变异（转换、颠换、插入、缺失等）所引起的 DNA 序列多态性。

SNP 有多种检测分析技术，如已有已知 DNA 序列，可将其比对 DNA 序列数据库（包括参考基因组或近缘物种参考基因组），来鉴定其中存在的 SNP。此外，如果 SNP 位于某些内切酶识别位点，也可利用 SNP 两侧的序列设计引物进行 PCR，并利用内切酶酶切 PCR 产物后电泳，将其转化为共显性的 CAPS 标记。另外，也可设计引物将 SNP 放到引物 3』末端，通过扩增条带的有无，将其转化为 PCR 显性标记。更为直接的方法是进行 DNA 测序或者利用 DNA 芯片杂交技术进行检测。

Tips：dCAPS 标记，CAPS 标记的一个变种，用于当 SNP 没有引起内切酶识别位点改变的情况下，通过在引物序列中引入碱基错配，错配碱基与 SNP 组合形成一个酶切位点，PCR 扩增后利用酶切即可产生不同大小的酶切产物。



SNP 标记的优点：SNP 数量多，分布广泛；稳定性高；共显性；适于快速、规模化筛查。

SNP 标记的缺点：如果用测序或 DNA 芯片杂交的方法，成本较高。



分子标记与全自动核酸蛋白分析系统的邂逅

分子标记技术，几经发展，但仍然存在着实验操作复杂，检测周期长，成本高，易造成污染，分辨率不够、结果不美观等问题。但当分子标记邂逅了全自动核酸蛋白分析系统，这些问题则迎刃而解，不再需要转印、银染等步骤，降低了成本、简化了实验流程、缩短了周期也消除了污染。

全自动核酸蛋白分析系统可以直接检测限制性酶切或者 PCR 之后的产物，不在需要跑胶，转印、同位素标记、银染等步骤，也不需荧光标记，只需将 PCR/酶切产物放于仪器样品盘，全自动上样电泳出结果，操作简便，分辨率高，灵敏度高，结果以数字峰形图和模拟凝胶图呈现，无污染无伤害。既不需要漫长的等待、接触剧毒的制胶染色过程，也不需花费高昂的成本，即可获得清晰可靠的结果。






最佳分辨率可达 1-4bp，1-96 个样本灵活上样，数据分析简便灵活，可挑选任意结果进行统一分析。其超高的分辨率不仅仅满足了分子标记这一大需要，还可以监测引物和探针的纯度、检测食源性致病菌、进行病毒分型等。