​毛细管电泳技术在 NGS 平台样本质控中的应用

一、抽提核酸质控（cf/ct DNA，Total RNA，mRNA，外泌体 RNA）

核酸抽提是测序的第一步，抽提质量直接影响后期建库的质量及下机数据的质量。目前提取的核酸种类，已由常规的 Total RNA、DNA 和蛋白质，扩增到各类新兴的小片段核酸的提取，例如 cf/ct DNA、mRNA，外泌体 RNA 等等。此类样本的核酸提取试剂盒非常多，但由于本身含量低，加上抽提过程中的损失，如何完美地完成低浓度核酸样本的质控显得尤为重要。

Cf-DNA（cell free DNA）和 ct-DNA（肿瘤细胞释放的循环 DNA）的检测，主要是看主带分布是否在 160～180bp，是否有大片段残留等等。毛细管电泳仪可轻松快速获得核酸片段分布的峰图及所检出的核酸条带的 bp 大小，直观且准确。（见图 1&2）
 

图 1  Cf-DNA 的质控（毛细管电泳结果）
 

图 2 Ct-DNA 的质控（毛细管电泳结果）

针对 Total RNA 的质控，可根据毛细管电泳仪给出的直观的 RNA quality number 来判断样本的质量，RQN 值是对 28S 和 18S 质量及浓度评估后的反应，RQN 值大于 7 即样本可用。（见图 3）。
 

图 3 Total RNA 的质控（毛细管电泳结果）

mRNA（message RNA），由 DNA 转录而来，是蛋白质合成的模版，目前在无创液体活检领域正受到越来越多的重视（见图 4）。此外，Exosome (外泌体) 中的 mRNA、miRNA 和 Protein 有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
 

图 4  mRNA 的质控（毛细管电泳结果）

Exosome（外泌体）是活细胞分泌的直径约为 30～150nm 的膜性囊泡，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。Exosome 的定性和定量研究正处于快速发展阶段，同时，循环生物标志物的市场也存在着机遇和挑战。不过，无创产前检测技术的成功让人们相信，循环生物标志物有望在肿瘤及其他疾病的诊断上发挥作用。但外泌体抽提的 mRNA 或 miRNA 浓度极低，需要高灵敏的仪器进行检测，毛细管电泳可达到所要求的灵敏度，而且分辨率高，可以完美完成低浓度外泌体样本的质控。（见图 5）
 

图 5 外泌体 RNA 的质控（毛细管电泳结果）

二、文库（library）质控

随着新一代测序仪（NGS）的技术发展，其使用范围已扩展到 de novo 测序、变异、外显子组和基因表达分析等领域。为了得到良好的测序结果，需要掌握 NGS 文库的大小分布和浓度。

目前，为了确认 NGS 文库的大小分布，一般使用琼脂糖凝胶电泳和微流控片段分析仪作为主要手段。为了确认浓度，还需要配备实时荧光定量 PCR 仪和荧光分光光度计。因此，从文库制备到质量控制的操作是一系列复杂的手工作业，而且单样本的两项质控总成本较高。现在兴起的全自动毛细管电泳，可以较低的成本完成对文库片段大小及浓度的质控，且灵敏度高，可准确地检测接头残留情况，是现在 NGS 公司值得考虑的另一质控手段（见图 6）。
 

图 6 文库的质控（毛细管电泳结果）