Vanquish Flex-ISQ EM结合Chromeleon IPD助力寡核苷酸分析

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寡核苷酸药物的现状

在1998年至2021年间获得批准上市的寡核苷酸药物有13种，见表1^[1]。多年来，基于寡核苷酸的治疗方法在临床上取得了快速的进展，可用于多种疾病的治疗，如心血管疾病、神经系统疾病、代谢疾病、癌症等。目前正在进行大量涉及寡核苷酸药物治疗的临床试验。

表1. 已获批的寡核苷酸药物的作用机理

和靶向疾病^[1]

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寡核苷酸药物（RNA治疗）的优势

众所周zhi，RNA药物已经成为各种新的治疗策略的理想候选方案，其相对于传统治疗药物的主要优势如下^[1]。

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可靶向“无药可治”的目标

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以RNA为基础的药物能够靶向细胞内几乎任何遗传成分，见图1^[1]；其中许多成分使用其他技术可能被认为是“无药可治”的，包括小分子和抗体药物。

图1.RNA疗法可以靶向不同的细胞遗传成分^[1]

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可快速生产

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一般来说，新型小分子或抗体药物从开发到生产需要数年时间。然而，一旦确定了RNA的化学结构和递送方式，RNA药物就可以被快速设计、合成并用于临床试验。CO  VID-19大流行能够被遏制且显著降低感染者疾病严重程度的原因之一是针对CO  VID-19的疫苗开发和生产速度极快。

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具有长效作用

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虽然天然RNA很容易被天然核酸酶降解，但合成RNA进行各种修饰后，其稳定性将大大提高。此外，当RNA被脂质体等载体包裹时，在系统给药后，RNA能有效避免核酸酶的攻击，从而延长寿命。

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可进行个性化治疗

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对RNA化学结构及其递送系统进行个性化设计，即可针对个体特殊疾病开发对应的RNA药物，且速度快、成本低。

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无遗传毒性风险

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与DNA药物治疗相比，RNA治疗没有显著的遗传毒性。这是因为DNA分子通过病毒载体被传递到细胞中，这种载体有可能整合到基因组中并导致突变。而使用RNA药物治疗可以避免这种潜在风险。

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寡核苷酸药物(mRNA疫苗)的商业化

CO   VID-19使mRNA 疫苗从一项相对小众的技术迅速成为主流，目前全球使用了数亿剂mRNA疫苗。由于mRNA生产具有模块化特性，Moderna、BioNTech和CureVac等公司开发mRNA用于癌症疫苗、蛋白质替代疗法和其他疫苗。这是因为mRNA不同于小分子和蛋白质药物，它可以被定制以编码几乎任何蛋白质，同时保留几乎相同的化学特征。这使得核苷酸修饰、脂质纳米颗粒（LNP）配方和制造等其他关键技术在本质上可以保持不变。自2012年以来，一项临床前概念研究表明，mRNA疫苗非常适合快速应对流行疾病，而CO   VID-19在全球的肆虐提出了将这些技术商业化的迫切需求^[2]。

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赛默飞Vanquish Flex-ISQ EM结合Chromeleon IPD助力寡核苷酸分析

赛默飞生物兼容的Vanquish Flex超高效液相色谱仪结合单四级杆质谱仪ISQ EM，见图2，在离子对反相色谱流动相体系下使15T、20T、25T、30T、35T的寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸（Oligodeoxythymidines，Oligo (dT)n）实现分离。并通过Chromeleon色谱数据系统配备去卷积权限（Intact Protein Deconvolution，IPD）同时运行色谱方法、采集质谱数据，以及利用IPD功能确定不同长度寡核苷酸片段的分子量。

图2.Vanquish Flex超高效液相色谱仪-单四级杆质谱仪ISQ EM

仪器配置：

• 系统底座：Vanquish System Base (VF-S02-A-02)

• 泵：Vanquish Dual Pump F（VF-P32-A, 150µl静态混合器，50µl 毛细管混合器）

• 自动进样器：Vanquish Dual Split Sampler FT (VF-A40-A, 25µL定量环)

• 柱温箱：Column Compartment H (VH-C10-A，主动预加热器)

• 检测器：Variable Wavelength Detector C (VC-D40-A，2.5ul流通池)

              ISQ EM

•色谱软件： Chromeleon 7.3.0配备去卷积权限PN:7200.0046

色谱条件：

• 色谱柱：C18 column，1.7µm，2.1×50mm

• 流动相：A：15mM TEA和400mM HFIP水溶液；B：50%流动相A-50%甲醇

• 流速：0.2 mL·min-1，梯度洗脱见表2

• 进样量： 25ul

• 柱    温： 60℃（still air）

• UV检测器：260nm，5Hz

• 自动进样器温度：4℃

表2. 梯度洗脱程序

质谱参数：

• Vaporizer temperature：350℃

• Ion transfer tube temperature：350℃

• Source voltage：-2000 V

• Sheath gas pressure：75 psi

• Aux gas pressure：7.5 psi

• Sweep gas pressure：0 psi

• Full scan Mass range：600-2000 m/z

• Dwell/scan time：0.5 s

• Polarity：Negative

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实验结果与讨论

如图3所示，在该色谱条件下五种寡核苷酸可实现良好分离。在m/z 600-2000范围内对15T、20T、25T、30T、35T寡核苷酸的所有电荷态进行质量确认，发现不同长度寡核苷酸的质量准确度良好，质量偏差＜0.2 Da。

图3. Oligo (dT)n紫外色谱图和总离子流图

利用Chromeleon色谱数据系统的IPD功能解析寡核苷酸分子量，分析参数设置与结果界面如图4所示。连续进样4次，通过IPD去卷积功能确认15T、20T、25T、30T、35T寡核苷酸的相对分子质量，见表3，质量准确度范围为0.00Da-0.47Da，且重复性很好，相对标准偏差（RSD）＜0.006%。  

图4. Chromeleon去卷积功能解析分子量软件界面

（1）进样序列；（2）目标组分列表；（3）去卷积参数设置；（4）和（6）总离子流图；（5）全扫描质谱图；（7）去卷积谱图；（8）源质谱图；（9）去卷积结果组成列表（点击查看大图）

表3. 寡核苷酸去卷积结果

展望

寡核苷酸的质量控制需要开展大量实验，以进行分子量确认和样品纯度与产率的测定。由于寡核苷酸在260 nm处有很强的吸收，因此可以很容易地通过紫外检测进行定量。然而，分子量确认需要质谱分析；质量控制也需要一个快速和稳健的方法，以确保实现高通量检测。以上均可以通过将赛默飞生物兼容的Vanquish Flex超高效液相色谱仪与单四极杆质谱仪ISQ EM结合来实现。ISQ EM是专为色谱仪的日常应用和操作而设计的，它完全集成到Chromeleon色谱数据系统中，该系统具有完整蛋白、多肽和寡核苷酸ISQ EM数据去卷积分析能力，具体方法可参照相关应用文献^[3-6]。

参考文献：

[1] Kim YK. RNA therapy: rich history, various applications and unlimited future prospects. Experimental & Molecular Medicine. 2022, 19, 1-11.

[2] Webb, C., et al. Current status and future perspectives on MRNA drug manufacturing. Molecular pharmaceutics. 2022, 19, 1047-1058.

[3] AN 000457: High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control.

[4] AN 72820：Oligonucleotide characterization for quality control and increased productivity by single quadrupole mass spectrometer with extended mass range.

[5] AN 22013：基于Chromeleon软件的核酸样品分子量合规质量控制.

[6] TN 73670：Quality control of oligonucleotides with a single quadrupole mass.

[7] AN 72818:  Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV and single quadrupole mass spectrometric detection