Orbitrap Exploris 480 全新一代Q Exactive旗舰机(第二期)

上一期中我们简单介绍了Orbitrap Exploris™ 480的设计原则和硬件性能，在这期的微信稿中我们一起来领略一下Exploris 480的强悍性能，以及新的软件特性如何将蛋白质组学推向一个新的高度。

1.Orbitrap Exploris™ 480的鉴定性能

Exploris 480是在Q Exactive HF-X的基础上改进而来，因此其绝对性能指标也是达到了新的高度。其最高扫描速度为40Hz，与Q Exactive HF-X一致。相比Q Exactive HF-X，Exploris 480有着更高的分辨率和灵敏度，更宽的质量范围和更为丰富的定量模式和选装模块。

性能指标

性能：强悍的性能指标带来的是不断突破记录的鉴定能力

上样500ng – 1μg Hela全细胞酶解产物，单针60分钟的梯度可实现超过5,000个蛋白的鉴定（图1）。

图1. 60分钟梯度Exploris 480的蛋白鉴定数量

非标定量

在Hela细胞样品中掺入酵母样品来考察非标记定量的准确性亦得到了非常优良的结果，由于动态范围和谱图质量的提升，在非标记定量的实验中“Match Between Runs”组件的效果得到了更加明显的体现（图2）。

图2. Orbitrap Exploris™ 480进行非标记定量的性能评估（点击查看大图）

2.兼容全新一代FAIMS Pro，进一步提升定性定量能力

在2018年9月份的HUPO上，赛默飞推出了全新一代的FAIMS Pro (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry, 高场非对称波形离子迁移谱)，该接口可搭载于TNG系列的质谱仪，例如Orbitrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos质谱仪。搭载该接口可显著提升质谱的定性定量能力，一经面世即受到市场的热捧。

Orbitrap Exploris™ 480也采用了TNG式样的离子源，因此可以选配FAIMS Pro来进一步提升仪器能力。FAIMS Pro是一种大气压条件下的离子迁移谱，对于肽段样品来说主要通过肽段带电性质的不同来进行分离，从而作为一种在线的气态样品分级手段来提高复杂样品的定性和定量效率（具体内容请见相关阅读）[1, 2]。将FAIMS Pro作为在线分级手段分别用-40CV/-55CV/-65CV进行60分钟采集的话可轻松实现54,000+个unique peptide, 对应6,300+个蛋白的鉴定。

3.前所未有的TMT定量体验

困扰：对于10标以及11标的TMT定量来说我们一直受到两个问题的困扰。

1第一个问题

10标TMT的相邻报告离子基团仅存在质量亏损级的质量差异，因此我们需要采用50,000的分辨率进行采集，从而使得扫描速度变慢，降低了对样品的测序深度。

2第二个问题

共流出肽段的干扰，由于Q Exactive系列仪器无法采集三级质谱，因此我们只能在采集二级质谱时通过减小母离子隔离窗口，并且关闭APD选项，然后在数据后处理时筛选干扰小于25%的二级谱图来进行TMT定量从而尽可能的缓解这一影响。

解决：这一系列问题在Orbitrap Exploris™ 480上都给出了完美的解决办法。

1对于第一个问题

对于第一个问题, Exploris 480上搭载了Turbo-TMT选项，该选项实现了在低分辨采集模式下（Res = 15,000）通过ΦSDM的谱图后处理算法使得报告离子的分辨率达到了50,000，从而轻松区分仅存在质量亏损级差异的报告离子（图3）。这样就实现了在不影响报告离子分辨率的情况下极大的提升了谱图扫描的速度，从而保证了复杂样品的测序深度。

图3. Turbo-TMT选项的工作流程示意（点击查看大图）

2对于第二个问题

而对于共流出肽段干扰的问题，Exploris 480给出了两个非常聪明的解决办法。一是Precursor Fit的二级触发选项; 二是FAIMS Pro用于基于价态的肽段分级。Precursor Fit选项通过一级质谱的数据计算目标母离子在隔离窗口的含量，只有当目标母离子的含量超过阈值（一般为75%）时才会触发二级（图4）。这样使得母离子会尽可能在其色谱洗脱峰的顶端来进行二级质谱的采集，一来缩短离子注入的时间，加快扫描速度，二来通过减少干扰来获得更为准确的定量数据。

图4. Precursor Fit选项的工作流程示意图（点击查看大图）

共流出肽段的干扰一般都来自于不同价态的肽段，而FAIMS Pro作为一个针对价态的在线分级手段毫无疑问可以缓解共流出肽段干扰这一问题。采用TMT11标的敲除了不同基因的酵母样品进行测试，发现启用了Turbo-TMT, Precursor Fit和FAIMS Pro选项后显著提升了样品的定量深度和准确性（图5）。

图5.Turbo-TMT, Precursor Fit和FAIMS Pro选项提升TMT定量的深度和准确性（点击查看大图）

本期新品连载介绍了 Orbitrap Exploris™ 480质谱仪卓越的定性能力，FAIMS Pro可选组件以及对TMT定量的改进。

这就够了吗？不，Orbitrap Exploris™ 480带来的惊喜远不止于此！

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参考文献：

1.Hebert, A.S., et al., Comprehensive Single-Shot Proteomics with FAIMS on a Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer. Anal Chem, 2018. 90(15): p. 9529-9537.

2.Pfammatter, S., et al., A Novel Differential Ion Mobility Device Expands the Depth of Proteome Coverage and the Sensitivity of Multiplex Proteomic Measurements. Mol Cell Proteomics, 2018. 17(10): p. 2051-2067.

3.Bruderer, R., et al., Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.

4.Peterson, A.C., et al., Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(11): p. 1475-88.

5.Meier, F., et al., BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods, 2018. 15(6): p. 440-448.

6.Gallien, S., S.Y. Kim, and B. Domon, Large-Scale Targeted Proteomics Using Internal Standard Triggered-Parallel Reaction Monitoring (IS-PRM). Mol Cell Proteomics, 2015. 14(6): p. 1630-44.