从连续波EPR、脉冲EPR到快速扫描EPR的发展

作者：Ralph Weber博士，Bruker BioSpin高级EPR应用科学家

　　电子顺磁共振（EPR）也被称为电子自旋共振（ESR），是一种测量电子自旋弛豫时间的方法，已成为一种应用广泛的工具。EPR是一种无损分析技术，是直接检测顺磁性物质的唯一方法。可以在固体、液体、气体、细胞和生物体内对自由基和过渡金属离子进行识别与量化，EPR可用于研究电化学、氧化还原化学、光化学、生物学和催化等化学过程中涉及的金属核心和自由基。

　　发现EPR

　　EPR最早是由Yevgeny Zavoisky于1944年发现的，他在含水氯化铜（CuCl2•H2O）、硫酸铜（CuSO4）和硫酸锰（MnSO4）等盐中检测到了EPR信号。1虽然EPR信号很可能以前也被观察到过，但在Zaviosky的研究之前，科学界普遍认为此种结果是不可再现的。2

　　他的观察导致了第一台EPR波谱仪的开发，最初使用的是MHz频段。牛津大学和其它实验室几乎同时开发出了EPR，并开始使用微波频率，而X波段（~10 GHz）很快就成为了最常用的EPR频段。第二次世界大战后，雷达部件的可用性推动了这一进展。20世纪50年代中期，商用EPR波谱仪问世后不久，人们就开发了一种弱煤样品，作为波谱仪信噪比（S/N）测试。规定的弱煤测量条件同时对波谱仪进行了几个方面的测试。

　　在制药工业中，EPR被用于监测产品稳定性、杂质分布、降解、风味稳定性和保质期，以进行质量和过程控制。在结构生物学中，EPR可提供对酶、膜蛋白、RNA和DNA的结构、功能及反应机制的深入了解。生物医学EPR应用则包括检测自由基，如活性氧（ROS）和活性氮（RNS），以及对氧化应激和细胞损伤的观察与评估。从化学结构到分子间相互作用的结构观察，都是通过连续波和脉冲EPR技术获得的。

　　CW和脉冲EPR

　　多年以来，连续波（CW）EPR在过渡金属化学、有机化学和生物化学中极为广泛的应用转移了人们对弛豫的关注，并占据了该领域的主导地位。许多自旋系统具备在室温下记录CW-EPR谱的能力，加之其高灵敏度，意味着大多数EPR应用仍然使用CW方法。从在核磁共振（NMR）中发现自旋回波开始，大约十年后其全部潜能才在EPR中实现。电子自旋回波封装调制（ESEEM）的开发是一项重大突破。它被证明是对电子-核双共振（ENDOR，一种结合了EPR和NMR技术）的一种强有力的辅助，不仅能测量较大的超精细耦合，还能测量在不成对电子环境中与核自旋之间小得多的偶极相互作用。ENDOR在1956年被引入固体物理学。3这项研究阐明了对顺磁中心周围核环境中超精细相互作用的探测情况。这是早期EPR发展过程中的一个阶段性变化，后来扩展到溶液中的自由基上。

　　EPR的优势之一是用户可以选择弛豫时间或长或短的体系，以便对混合物进行差分测量。对于某些过渡金属复合物和大多数镧系复合物，短弛豫时间要求在低温下记录EPR谱。同样，为了测量自由基之间的相互作用，需要在低温下使横向弛豫时间足够长，从而获取所需的信息。因此，低温技术的发展是EPR发展中的一个组成部分。

　　除了电子-核相互作用之外，脉冲EPR还能够测量电子-电子相互作用，并导致了脉冲电子-电子双共振（PELDOR）方法的出现，它也被称为双电子-电子共振（DEER），用于测量聚合物、蛋白质和核苷酸中不成对电子间的距离。5这项技术现在已广泛用于结构生物学中的结构阐释。

　　快速扫描EPR的发展

　　早期的EPR实验大多采用CW法进行，但脉冲和快速扫描（RS）-EPR技术的发展使EPR技术进入了日益多样化的领域。

　　丹佛大学（DU）化学与生物化学系教授Sandra和Gareth Eaton博士专注于驰豫研究，开发驰豫测量工具，并在深入理解驰豫的基础上开发EPR的应用。

　　Eatons和他们在DU的团队在脉冲和CW-EPR技术的发展中发挥了重要作用，他们利用这些技术来测量自旋距离。Eatons研究小组已经将这两项技术应用于自旋标记的高铁肌红蛋白、自旋标记的碳酸酐酶，以及其它含有两个不成对电子的生物分子。

　　Eatons及其团队最新的创新之一是RS-EPR技术的开发，该技术结合了CW和脉冲EPR，作为研究不成对电子的第三种方法。与CW和脉冲EPR相比，快速扫描为大多数样品提供了更高的灵敏度，并开启了研究更快的反应动力学的大门。

　　在RS-EPR中，磁场在比电子自旋弛豫时间短的时间内扫描共振。快速扫描信号的反褶积提供了吸收波谱，相当于常规一阶导数CW波谱的首次积分。

　　RS-EPR使研究人员在每次扫描中能经常检测到全谱，并在不饱和情况下提供更高微波功率的应用。在进行低频EPR成像时，这些优点尤其值得注意。快速扫描波谱的正交检测允许同时测量自旋系统响应的吸收和色散分量。在线性扫描或正弦扫描的递增场方向和递减场方向上都可以获得波谱。将所有这些和相干平均中固有的噪声滤波结合起来，可以显著提高信噪比。

　　尽管仍处于早期阶段，但有强有力的证据表明，RS-EPR可以取代70年来一直占据标准地位的CW-EPR。6 Eatons使用RS-EPR所进行的工作的一项重点是开发一种临床前成像仪，以满足生物医学研究人员和肿瘤学家进行肿瘤生理学测量的需要。这包括测量O2浓度、pH值和氧化还原状态。DU团队正在开发一种原型仪器，可以进行用于肟试验的脉冲EPR和RS-EPR，以便对其它生理学参数进行进一步的低频测量。与CW-EPR相比，RS-EPR具有更高的灵敏度、更佳的空间分辨率、更短的采集时间，并能在单位时间内进行更多的临床前成像测量，因而可应用于临床前成像。这种改进对于体内研究尤其重要。

　　EPR的未来

　　在资金允许的范围内，EPR技术正继续朝着多个方向发展，包括更高和更低的微波频率、磁场强度、温度，以及更大和更小的样品。DU继续聚焦于面向疾病诊断的临床成像以及监测医疗。RS-EPR技术发展迅速，有望在增强灵敏度方面迈出新的步伐，从而形成新的成像能力。

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　　参考文献

　　1. Zavoisky, EK. (1944). "Paramagnetic Relaxation of Liquid Solutions for Perpendicular Fields, ZhurEksperiment I Theoret. Fiz, Vol 15, pp.344-350.

　　2. Salikhov KM and Zavoiskaya NE (November 2015) Zavoisky and the Discovery of EPR, Resonance, pp. 963-968.

　　3. Feher G (1956) Observation of nuclear magnetic resonances via the electron spin resonance line. Phys Rev；103:834–835.

　　4. Hyde JS and Maki AH (1964) ENDOR of a free radical in solution. J ChemPhys； 40:3117––3118. doi: 10.1063/1.1724957.

　　5. Glaenzer J, Peter MF and Hagelueken G (2018) Studying structure and function of membrane proteins with PELDOR/DEER spectroscopy  -The crystallographers' perspective, Methods； 147: 163-175.

　　6. Eaton SS, Shi Y, Woodcock L, Buchanan LA, McPeak J, Quine RW, Rinard GA, Epel B, Halpern HJ and Eaton GR (2017) Rapid-scan EPR imaging, Journal of Magnetic Resonance, 280: 140-148.

　　关于作者

　　Ralph Weber博士在布朗大学开始接受科学训练，并在那里获得了化学、德国文学和语言学的学士学位。他在芝加哥大学继续其学业，并获得化学博士学位，主要研究蛋白质和镧系化合物的EPR和ENDOR。随后，又获得两个博士后职位。在荷兰莱顿大学，他利用ODMR（光学探测磁共振）研究了分子的激发态，并设计和建造了一台高频脉冲EPR谱仪。在麻省理工学院，他通过固态NMR研究脂类中的运动动力学，是设计和建造一台包含大功率回旋管的DNP（动态核极化）波谱仪的初始项目成员之一。1989年，他加入Bruker公司。他负责大量EPR文件，还为脉冲、高频和成像应用提供客户支持。目前，在一项五年期NIH拨款计划中，他与杜邦的Eatons担任一起联合首席研究员，开发临床前EPR成像技术，并促进其在制药行业的应用。