PCR反应体系构建引物应遵循的原则

　　PCR(Polymerase Chain Reaction)反应体系是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。具有易自动化\特异、敏感、产率高、简便、快速、重复性好等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA的片段于在数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；或者可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中，扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去需要几天甚至几星期才能做到的事情，用PCR技术只需在几小时以内便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

　　PCR反应体系构建中引物是特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核昔酸链作引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

　　PCR反应体系构建引物应遵循的原则：

　　1.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；

　　2.引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；

　　3.避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；

　　4.引物碱基：G+C含量以40％-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC一般随机分布，避免5个以上的嚎吟或e陡核昔酸的成串排列；

　　5.引物3’端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；

　　6.引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列一般要有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；

　　7.引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

　　引物量：每条引物的浓度0.1-1μmol/L或10-l00pmol/L，以Z 低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。