APFlncRNA通过靶向miR-188-3p调节自噬和心肌梗死

 摘要：  

  异常自噬与多种心血管疾病相关。长非编码RNA（lncRNAs）作为基因调控中新出现的调控因子，如何调节心脏中的自噬作用尚不清楚。本文研究发现，一种称为自噬促进因子（APF）的长非编码RNA，可以通过定位miR-188-3p和ATG7调节自噬细胞死亡。结果表明，miR-188-3p通过靶向ATG7抑制自噬和心肌梗死。此外，发现APF lncRNA调节miR-188-3p，从而影响ATG7表达，以及自噬细胞死亡和心肌梗死。目前的研究揭示了自噬过程的新型调节模型，包括心脏中的APF、miR-188-3p和ATG7。它们的表达水平调节可以作为心肌梗死和心力衰竭的新型治疗策略的潜在靶标和诊断工具。

  方法：  

  心肌细胞培养和处理。  

  从雄性小鼠（1-2天）中分离心肌细胞。  

  细胞死亡测定。  

  Western印迹分析。  

  荧光素酶构建体和转染。  

  定量逆转录PCR。（茎环逆转录PCR（qRT-PCR））  

  实时RT-PCR进行绝对定量。  

  制备亚细胞级分。  

  使用生物素化DNA探针和miRNA的Pull-down测定。  

  Northern印迹分析。  

  动物实验。

  结果：

  1、 miR-188-3p参与调节ATG7的表达。

  （a）miR-188-3p抑制ATG7的表达。用miR-188-3p和阴性对照（mimic-NC）转染心肌细胞。通过免疫印迹分析ATG7的水平。  

  （b）在ATG7的3’UTR区域中推测的miR-188-3p结合位点。  

  （c）miR-188-3p的敲除增加ATG7的表达水平。用anta-188-3p和antagomir阴性对照（anta-NC）转染心肌细胞。  

  （d）miR-188-3p减弱A/R（缺氧再氧化）后ATG7水平的增加。用miR-188-3p和NC转染心肌细胞，然后暴露于A/R。  

  （e）ATG7靶保护剂可以减弱由miR-188-3p诱导的ATG7的减少。用ATG7靶标保护剂（ATG7-TPmiR-188-3p）和对照（ATG7-TPcontrol）转染心肌细胞。  

  （f）ATG7靶标保护剂抑制A/R诱导的ATG7上调。用ATG7-TPmiR-188-3p和ATG7-TPcontrol转染心肌细胞，然后暴露于A/R。  

  （g）显示了ATG7野生型（WT）和突变型（Mut）的3’UTR区，miR-188-3p的结合位点。  

  （h）miR-188-3p抑制ATG7翻译。用miR-188-3p、mimic-NC、野生型ATG7-30UTR（ATG7-3'UTR-wt）、突变的ATG7-30UTR（ATG7-30UTR-mut）的荧光素酶构建体转染HEK293细胞，分析荧光素酶活性。

  2、 miR-188-3p在病理条件下抑制自噬。

  （a）将心肌细胞暴露于A/R，并通过qRT-PCR分析miR-188-3p水平。  

  （b）miR-188-3p抑制由A/R诱导的GFP-LC3的累积。  

  （c）将LC3-I转化为LC3-II的免疫印迹。显示LC3-II的western印迹的光密度分析（下图）。  

  （d）显示了EM图像和自噬空泡的定量。箭头表示自噬体，核表示为N。  

  （e）细胞死亡的量化。  

  （f）向小鼠注射miR-188-3p或mimic-NC，然后对其进行45分钟缺血和3小时再灌注。显示自噬空泡的定量。  

  （g）将小鼠心脏切片，用TTC染色并固定死的或梗死的组织（白色），标出活组织（红色）。通过平面法量化梗塞，并表示为危险区的百分比。

  3、 APF和miR-188-3p之间的相互作用。

  （a）用A/R处理后的APF表达水平。  

  （b）APF的RNA含有与miR-188-3p互补的位点。  

  （c）荧光素酶测定。HEK293细胞用miR-188-3p和NC转染，然后用Luc-APF-wt或Luc-APF-mut的荧光素酶构建体转染，分析荧光素酶活性。  

  （d）miR-188-3p可以在体内直接结合APF。用生物素化的野生型miR-188-3p（Bio-188-3p-wt）和生物素化的突变型miR-188-3p（Bio-188-3p-mut）转染心肌细胞。使用不与APF互补的生物素化miRNA作为阴性对照（Bio-NC）。转染后48小时，收获细胞用于基于生物素的pull-down测定。  

  （e）APF可以在体内结合miR-188-3p。将心肌细胞裂解物与APF探针或随机探针包被的磁珠孵育。洗脱RNA并通过northern印迹分析。  

  （f）强制表达APF增加APF的表达水平。用腺病毒APF或β-gal感染心肌细胞。感染后24小时，分析APF水平。 

  （g）APF抑制miR-188-3p活性。用腺病毒APF或β-gal感染心肌细胞，然后用miR-188-3p和ATG7-3’UTR转染，分析荧光素酶活性。

  4、 APF在心肌细胞中传递自噬信号。

  （a）通过siRNA技术敲除APF，降低APF的表达水平。  

  （b）APF的敲除，抑制A/R处理后的LC3-I向LC3-II的转化。  

  （c，d）APF的敲除抑制GFP-LC3的累积。  

  （e，f）APF的降低减少自噬空泡和细胞死亡。

  5、 APF调节体内自噬。

  （a，b）APF的敲除减少了I/R损伤的自噬。免疫印迹分析LC3水平。  

  （c）APF的敲除减少了体内I/R损伤的心肌梗死。  

  （d）APF的敲除在I/R损伤后呈现显着保留的心脏功能。

  6、 APF通过miR-188-3p和ATG7发挥其自噬作用。

  （a）APF的敲除降低ATG7的表达水平。  

  （b）强制表达APF诱导ATG7水平的增加。  

  （c）APF降低miR-188-3p对ATG7表达的抑制作用。  

  （d，e）ATG7靶标保护剂减弱APF敲除对A/R诱导的自噬的抑制作用。

  参考文献：  

  APF lncRNA regulates autophagy and myocardial infarction by targeting miR-188-3p.  

  2015-Nature communication, IF= 11.329