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Lnc-mg是促进肌发生的lncRNA

发布时间: 2019-03-19 19:24 来源:南京集思慧远生物科技有限公司

摘要:

  最近的研究表明lncRNAs作为肌发生和成人骨骼肌再生的必要调节器起重要作用。然而,lncRNAs在成人骨骼肌干细胞(MuSCs)的肌分化和肌发生中的特定作用仍然未知。本文鉴定了在骨骼肌特异性富集的lncRNA(myogenesis相关lncRNA,简称lnc-mg)。小鼠骨骼肌中,lnc-mg的敲除导致肌肉萎缩,运动期间肌肉耐力丧失。此外,lnc-mg的骨骼肌特异性过表达促进骨骼肌增生。原代骨骼肌细胞的体外分析显示lnc-mg在肌分化期间逐渐增加,并且过表达lnc-mg后促进细胞分化。推测lnc-mg作为小RNA-125b的竞争内源性RNA(ceRNA),控制胰岛素样生长因子2的蛋白质丰度,促进肌发生。本文研究将lnc-mg鉴定为肌肉细胞分化和骨骼肌发育的新型非编码调节剂。

  

  材料:  

  8周龄的C57B / 6J小鼠,每组3雄3雌。

  

  方法:  

  体外细胞培养和分化。  

  从小鼠中分离骨骼肌干细胞。  

  实时PCR分析。 

  细胞转染。  

  lnc-mg表达质粒、空质粒、shRNA(短发卡RNA)对照。  

  免疫荧光染色。  

  小鼠模型骨骼肌lnc-mg基因敲除。  

  微阵列分析过表达或敲除后的lnc-mg。  

  双荧光素酶测定。  

  生物素标记的miR-125b捕获。  

  Western免疫印迹。  

  ELISA分析。

  

  结果:

  

  1、 肌发生期间诱导骨骼肌富集的lnc-mg。  

  (a)未分化的MuSCs(GM)和分化5天的MuSCs(DM)中注释的lncRNA的微阵列热图。在分化的过程中,共有70个上调和12个下调lncRNA。  

  (b)小鼠各组织中lnc-mg表达量的实时PCR分析。在骨骼肌细胞中表达丰富。  

  (c)小鼠骨骼肌不同的肌组织和其他主要器官中的lnc-mg表达量分析。在各器官中都有表达,但不同的肌组织中表达量较高。 

  (d)骨骼肌干细胞分化5天期间,lnc-mg表达量的实时PCR分析。在肌分化期间逐渐增加。  

  (e)通过对lnc-mg相关的mRNA进行GO功能富集也发现,主要是肌肉收缩和肌肉系统过程相关。

  

  

  2、 lnc-mg在体外促进MuSC分化。

  (a)对照shRNA、lnc-mg shRNA转染的MuSCs中的lnc-mg表达量。(敲除lnc-mg)  

  (b)免疫荧光染色。 

  (c)MyHC(肌球蛋白重链)阳性细胞的比较。  

  (d)Myog和Myod(肌原性标记基因)表达量。  

  (e-h)对照载体或lnc-mg载体转染的MuSCs中的lnc-mg表达量、免疫荧光染色、MyHC阳性细胞的比较、Myog和Myod表达量。(lnc-mg过表达)  

  lnc-mg敲除后,MuSCs的分化受到抑制,MyHC表达降低,肌小管数量减少;过表达后,MuSCs分化加强,肌小管数目增加。

  

  

  3、  lnc-mg敲除小鼠模型的形态和功能变化。  

  (a)对照和lnc-mg敲除小鼠的腓肠肌(GAS)、比目鱼肌(SOL)、伸缩肌(EDL)、胫骨前肌。敲除后重量变轻、体积变小。  

  (b)腓肠肌切片和平均肌纤维横截面积。敲除后面积变小。  

  (c)抗肌萎缩蛋白抗体处理后,腓肠肌切片和平均肌纤维横截面积。 

  (d)腓肠肌中测量肌肉纤维的尺寸分布。  

  (e)测量小鼠肌肉的僵直机能。敲除后下降。 

  (f)测量运动能力。敲除后下降。

  

  

  此外,构建了lnc-mg转基因TG小鼠模型,各种肌组织重量变多体积变大,肌肉的僵直机能和运动能力提高。

  

  4、 lnc-mg在体外作为miR-125b的ceRNA起作用。  

  研究人员对lnc-mg进行了细胞定位,发现胞质和核内都有,但是在分化的成肌细胞中主要在细胞质中。推测lnc-mg作为ceRNA,调控相应的miRNA靶向转录物。  

  (a)通过芯片检测了过表达和敲除细胞的miRNA表达变化,发现miR-125b在过表达细胞中下调,在敲除细胞中上调。  

  (b)miR-125b表达量分析。  

  (c)预测lnc-mg有miR-125b的结合位点,是其靶标。 

  (d)荧光素酶报告基因构建体:将具有miR-125b结合位点的lnc-mg和两个突变lnc-mg(lnc-mg-mut1和lnc-mg-mut2)插入psiCHECK-2载体中。  

  (e-h)通过荧光素酶检测,发现lnc-mg确实能结合miR-125b,影响其表达。只有miR-125b显着降低了lnc-mg报告物的荧光素酶活性(e),并且只有lnc-mg靶向位点被miR-125b识别(f)。用Antagomir-125b降低内源性miR-125b水平时,lnc-mg报告物的荧光素酶活性特异性增加(g,h)。

  

  有研究显示,miR-125b通过调控靶基因Igf2影响成肌细胞分化。因此,研究人员检测了过表达和敲降lnc-mg细胞中Igf2的表达,western blotting和ELISA结果表明Igf2蛋白表达分别增大和减少。

  

  

  5、 lnc-mg在体内作为miR-125b的ceRNA起作用。  

  小鼠转基因模型表明,lnc-mg通过竞争性地结合miR-125b,影响了Igf2的表达,而影响肌生成。因此,lnc-mg是通过典型的ceRNA机制影响肌生成。  

  (a)对照和lnc-mg敲除小鼠肌细胞中miR-125b表达量。  

  (b)肌细胞中Igf2蛋白水平的Western印迹分析。  

  (c)血清中Igf2蛋白水平的ELISA分析。  

  (d)WT和TG小鼠GAS中miR-125b表达量。

  (e)WT和TG小鼠GAS中Igf2蛋白的蛋白印迹分析。  

  (f)WT和TG小鼠的血清Igf2蛋白水平的ELISA分析。

  

  

  亮点分析:  

  1、对于筛选到的lncRNA,从体内体外实验,过表达和敲除实验都进行了详细的验证;  

  2、lncRNA功能研究时,通过miRNA芯片筛选,从ceRNA角度进行详细的验证。

  

  

  参考文献:  

  Lnc-mg is a long non-coding RNA that promotes myogenesis.  

  2017-nature communication-11.329


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