全基因组表观遗传分析表明，DNA甲基化可能介导炎症性肠病的遗传风险

摘要：  

  炎症性肠病（IBD）可能是基因与环境相互作用产生的。本文研究了240个初诊病例IBD和190个对照的全基因组表观遗传范围内的DNA甲基化差异。通过全基因组重亚硫酸盐测序，鉴定到439个差异甲基化位点（DMP）和5个差异甲基化区域（DMR）。结合基因组数据和表观遗传数据，找出甲基化的数量性状位点。与VMP1甲基化相关的两个SNP位点，与已知的IBD的SNP位点连锁不平衡。TXK基因（DMR内的）与IBD相关的高甲基化，与全血和CD8+ T细胞的基因表达呈负相关，和其他的细胞不是这种关系。因此，IBD中位点特异性的DNA甲基化的变化，会引起潜在的基因型和细胞特异性的基因表达量的改变。  

  备注：先前的GWAS研究已经证明了200个SNP位点与IBD相关。

  材料与方法：

  样品收集和细胞分离。  

  在以下管中采集血液样品：9ml Z血清凝块激活空泡（Greiner，Frickenhausen，Germany），9ml K3 EDTA空泡（Greiner）和PAXgene血液RNA管（BD，NJ，USA）。将18-36ml的EDTA缓冲血液用于初始Ficoll（Ficoll-Paque，GE healthcare，Bucks，UK）密度梯度离心以获得外周血单核细胞。使用autoMACs Pro细胞分离器（Miltenyi，Germany）对用抗体包被的微珠（人CD14 +，CD8 +和CD4 +微珠，20ml / 1×107个细胞）标记的细胞进行免疫磁性分离。在初始CD14 +耗尽步骤后进行CD4 +分离。使用荧光抗体染色和流式细胞仪（FACS Aria II，BD，Germany）估计细胞纯度。在外周血单核细胞消耗后，将红细胞在冰上裂解（1,000ml dH2O，8.3g NH4Cl，1.0g KHO3和1.8ml 5％EDTA），通过离心回收白细胞。

  全基因组甲基化分析。  

  使用Illumina Human Methylation450平台（Illumina，San Diego，CA，USA）对外周血白细胞DNA进行亚硫酸氢盐转化和分析。病例、对照的不同的细胞随机分布在芯片上。使用R（R Foundation for Statistical Computing，Vienna）中的lumi，methylumi和minfi包处理数据。使用β混合分位数扩张（BMIQ）校正了阵列内和探针设计变异。使用ComBat校正阵列间批量效应。使用在minfi中实施的Houseman算法从甲基化数据估计细胞比例。使用limma对上述细胞比例连同年龄和性别作为协变量进行差异甲基化位置分析（DMP，单个CpG探针）。使用Holm校正对全血数据进行多重检验，使用Benjamini Hochberg FDR对分离的细胞数据进行多重检验。

  差异甲基化区（DMR）定义为在2kb距离内有三个或更多个连续探针，且甲基化变化方向相同。将Jostins等人描述的163个已知的与IBD相关的GWAS风险基因座附近的差异甲基化探针，和1,000个随机选择的相同大小的bin进行比较，使用Wilcoxon秩和检验。作为对照，还测试了IBD相关的DMP对于七种其它疾病（类风湿性关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，TB，I型糖尿病，阿尔茨海默病，IgG糖基化）的GWAS数据。

  全基因组亚硫酸氢盐测序。 

  对6个IBD病例（3个CD克罗恩病，3个UC溃疡性结肠炎）和3个对照进行全基因组亚硫酸氢盐测序。对DNA进行超声处理以产生大小为50-500bp的片段，使用AMPure XP珠（Agencourt Bioscience）对150-300bp的片段进行大小选择。使用Illumina TruSeq样品制备试剂盒按照Illuminas标准方案产生DNA文库。使用Agilent 2100生物分析仪对文库进行质量评估，并使用文库定量PCR试剂盒（Kapa Biosystems）估算浓度。使用Illumina HiSeq 2000平台进行PE 100bp DNA测序。  

  使用GEM比对器（v1.242）将reads比对到两个版本的人GRCh37参考基因组。同时考虑到观察到的碱基、碱基质量分数和每个读对的链来源来估计基因型和DNA甲基化状态。

  基因分型。  

  使用Nucleon BACC 3 DNA提取试剂盒（GE healthcare，Buckinghamshire，UK）提取全血白细胞DNA。使用Illumina Human CoreExome BeadChip芯片对患者进行基因分型。使用plink进行性别检查以鉴定和去除性别错配。使用matrixEQTL包估计MeQTLs和eQTLs。

  基因表达分析。  

  具有分离的细胞样品（n = 60）的个体，加上另外8名患者，用于基因表达分析中（总n = 68）。使用Allprep DNA / RNA miRNA通用试剂盒（Qiagen）提取分离的细胞RNA。使用PAXgene血液miRNA试剂盒（PreAnalytix，Switzerland）从PAXgene试管提取全血RNA。使用Agilent BioAnalyzer对RNA进行定量和评估质量，仅使用47个具有RNA完整性的样品用于下游分析。在使用MinElute RNA清除试剂盒（Qiagen）进行样品浓缩和清除后，使用GlobinClear（Ambion，Life Technologies USA）消除珠蛋白mRNA转录物。使用Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒（Ambion，Life Technology）扩增并生物化RNA。使用Agilent BioAnalyzer对cRNA进行定量和评估质量，大多数cRNA在1,000和1500nt之间。58℃，Illumina HT12 humanv4表达芯片杂交18小时。使用lumi和limma包装分析数据。

  研究结果：

  1、IBD相关的差异甲基化位点。 

  与对照相比，在IBD病例中有439个DMPs。 

  表1是全血中，炎症性肠病（IBD）病例与对照之间的top差异甲基化位点（DMP）。  

  A、炎症性肠病（IBD）相对于对照的top差异甲基化位点（DMP）的曼哈顿图。  

  B、Top DMPs的火山图和甲基化探针相对于基因的位置（IGR，基因间区；TSS，转录起始位点；UTR，非翻译区）。  

  2、IBD相关的差异甲基化区域。

  表二是全血中，炎症性肠病（IBD）病例与对照之间的5个差异甲基化区（DMR）列表。与对照相比，存在四个CD相关的DMR（VMP1，ITGB2，WDR8和CDC42BPB）和两个UC相关DMR（VMP1和WDR8  

  VMP1区域的详细表征。  

  A、在炎症性肠病（IBD，红色）和对照（蓝色）中的VMP1区域450K的芯片探针（三角形）。  

  B、使用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）数据（红线IBD，蓝线对照）绘制的相同的VMP1区域。  

  C、VMP1基因示意图。只显示了VMP1的前两个外显子。 

  D、450k芯片探针和WGBS数据在同一地点的相关性，用Pearson检验。X轴表示Chr 17（h19）坐标。

  3、DNA甲基化具有细胞类型的特异性。 

  A、主成分分析，显示全血的（i）DNA甲基化数据和（ii）基因表达数据。表明样品根据细胞类型聚类。 

  B、IBD病例与对照的特定细胞（CD4 +T细胞，CD8 + T细胞和CD14 +单核细胞）的差异甲基化位置（DMP）分析的火山图。  

  C、D、细胞特异性的DNA甲基化。  

  C、在全血中最差异的甲基化位点（RPS6KA2）在单核细胞中也低甲基化。与全血相比，单核细胞中病例和对照之间存在更大的差异，表明单核细胞可能负责全血中所见的DNA甲基化差异。  

  D、组蛋白脱乙酰酶4（HDAC4）中，单核细胞特异性的DNA甲基化。HDAC4是组蛋白脱乙酰酶的亚类，可以指示表观遗传机制之间的相互作用。

  4、差异甲基化可能由基因变异驱动。  

  IBD相关的DMP似乎与已知的IBD相关的GWAS基因座共定位。将439个IBD相关的DMP用于局部遗传关联（顺式甲基化数量性状基因座（meQTL））。上述五个DMR中的两个（VMP1和ITGB2）具有显着的遗传关联。  

  A、rs8078424的基因型与VMP1的DNA甲基化密切相关（cg16936953）（FDR校正的P = 8.80?10-5，线性模型）。 

  B、与对照相比，VMP1的DNA甲基化与炎症性肠病（IBD）病例状态强烈相关（Holm校正P = 2.2±10-13，线性模型）。 

  C、rs8078424基因型与IBD状态相关（两者都保持Hardy-Weinberg平衡）。

  D、与VMP1基因座（红色倒三角形）的甲基化相关的两个SNP位点（rs10853015和rs8078424，蓝色菱形）与已知的IBD-易感性SNP位点（rs1292053，绿色菱形）连锁不平衡。（rs1292053 -rs8078424，距离≈13072bp，r2 = 0.43和s1292053-rs10853015，距离= 185198，r2 = 0.43。）

  IBD特异性的甲基化差异可能由潜在的遗传变异驱动，并可能提供有助于疾病的遗传多态性。

  5、细胞特异性的DNA甲基化和基因表达相关。  

  全血、CD8 + T细胞、CD4 + T细胞和CD14 +单核细胞中的TXK（酪氨酸激酶）的DNA甲基化（a）和基因表达（c）。

  （b）显示了各样品中TXK基因表达和DNA甲基化之间的相关性。 

  TXK基因的与IBD相关的高甲基化，与全血和CD8 + T细胞中观察到的TXK基因表达的减少相关，而与其他细胞类型无关。

  亮点分析：

  1、采用全面的方法研究全基因组DNA甲基化，使用全基因组亚硫酸氢盐测序，Illumina 450K芯片和焦磷酸测序结合相应个体中的基因组和转录组数据，整合分析。  

  2、DNA甲基化可能由潜在的遗传变异驱动，表明遗传多态性有助于疾病变异。疾病相关的免疫细胞的细胞分选已经表明DNA甲基化和基因表达之间的微妙的细胞特异性关系。

  参考文献： 

  Integrative epigenome-wide analysis demonstrates that DNA methylation may mediate genetic risk in inflammatory bowel disease. 

  NATURE COMMUNICATIONS. 2016, IF= 11.329