大鼠生命历程中肠道微生物群与脑代谢组的关联研究策略

       文章题目：A strategy for association study on intestinal microbiomeand brain metabolome across lifespan of rats.  

  杂志：Analytical  Chemistry  

  影响因子：IF=6.0421

  摘要  

  人们越来越认识到微生物群-肠-脑轴在哺乳动物一生中对哺乳动物生长和健康的不同作用。大量研究表明，肠道微生物群及其代谢物广泛参与脑与肠的沟通。脑代谢组与肠道微生物的关联研究是一个活跃的领域，它提供了大量关于微生物、脑和肠道相互作用的信息，但数据大小和复杂的层次关系是形成重要的、可重复的结论的主要障碍。本研究采用多种分析平台和生物信息学方法，对雄性Wistar大鼠在生长过程中的脑代谢和肠道微生物群关联分析进行了两级策略的研究。轨迹分析表明，与年龄相关的脑代谢组和肠道微生物在总体变化模式上具有相似性。 四个高水平分类的相关对“代谢类型—细菌门”包含“脂质-螺旋菌”、“游离脂肪酸-厚壁菌门”、“胆汁酸-厚壁菌门”、“神经递质-拟杆菌门”在单元-多元相关分析和功能分析的基础上被筛选出。进一步鉴定了上述高水平关键对中的四组特异性“代谢产物-细菌”关联对。通过一项独立的动物研究验证了关键相关对的有效性。这种两级策略有效地识别了从系统多组学研究中获得的大数据集中的主要相关性，加深我们对大脑和肠道之间终生联系的理解。

  材料与方法

  动物材料：正常生长实验取出生后第1、3、7、12、24、56、111周的雄性大鼠全脑和肠内容物，每组6只，共42只。  

  在限制饮食验证实验中，12只雄性大鼠(4周龄)被喂食3周，然后6只(随机选择)饲喂Libitum，其余6只饲喂60%的Libitum 5周。

  主要检测平台： 

  代谢组：利用UPLC/QTOF-MS和GC/TOF-MS  

  微生物：IlluminaMiseq（16s V3）

  研究思路  

  图1. 研究工作流程

  研究结果

  1、脑代谢组和肠道微生物群在生命周期中的变化

  图2.在正常生长研究中，大脑代谢物和肠道微生物组分在不同年龄阶段的变化

  注：2a和2d是脑代谢物和肠道微生物组分。2b和2e是基于PCA和未加权UniFrac PCoA评分的脑代谢组和肠道微生物的年龄相关轨迹。7个年龄组代谢物类型(2c)和细菌门(2f)的相对丰度用彩色条形图(行归一化)表示。*和**分别表示p<0.05和p<0.01，用Krukal-Walli检验对7个年龄组进行比较。

  2、“代谢物种类-细菌门”水平的相关分析

  图3.正常生长研究中“代谢物类型-细菌门”水平的相关分析结果

  图3a显示了rCCA计算的每种代谢物类型和细菌门的负荷值(降序)。5种代谢物类型（脂肪酸、脂质、游离脂肪酸、吡啶和神经递质)）和6个菌门(衣原体、厚壁菌、绿菌门、螺旋菌门、硝化螺菌门和拟杆菌)的负荷值比其他高，表明它们对大脑代谢和肠道微生物组之间的整体相关性贡献更大。

  图3c-3j显示4个预测代谢功能的总体变化(图3c，3e，3g和3i)和4种相应的代谢物类型(图3d、3f、3h和3j)基本一致，代谢功能的变化相对较小。对丰度数据进行经典Spearman相关分析，估计各代谢物类型与每个细菌门的相关性(图3k)。鉴于上述结果、变化的丰度和生物学意义，选择“脂类-螺旋菌门”、“游离脂肪酸-厚壁菌门”、“胆汁酸-厚壁菌门”和“神经递质-拟杆菌”作为关键相关对(用红色突出显示，图3a和3k)，图31-3o为这些相关对的散点图。

  3、代谢物-细菌水平的相关性分析  

  图4.(a)脂类和螺旋菌门下属/种的显着相关对；(b)游离脂肪酸和厚壁菌下的属/种；(C)胆汁酸和厚壁菌门下的属/种；(D)神经递质和拟杆菌门下的属/种；红色和蓝色的线条表示正相关和负相关。连接最多的集线器节点以红色高亮显示。

  4、基于饮食限制研究的相关配对验证

  图5.正常生长(蓝色)和限制饮食(红色)研究中关键相关对的Spearman相关系数和散点图

  5a-5d分别为：(5a)Treponema.spp与28种甘油磷脂类，(5b)Facklamia.spp和19种游离脂肪酸，(5C)5种胆汁酸和Ruminococcus gnavus，(5D)在两项研究中5种神经递质和4种细菌的相关系数。*p<0.05。5e-5f分别显示了两项研究中4对代表对(红色高亮，图5a-5d)的相关系数散点图。

  饮食是肠道微生物组成及其代谢产物的一种强有力的调节因子。因此作者进行了一个独立的饮食限制实验，希望验证两个实验之间的关键对是否一致。选择与正常生长研究中相同的代谢物和细菌，按照相同的程序进行测定和预处理。对所有关键对进行Spearman相关分析。如图5a-5d所示，特定的“代谢产物-细菌”对的相关方向也基本一致，尽管图4d中的一些细菌在饮食限制研究中没有被观察到。图5e-5p分别显示了两项研究中6个具有代表性的“代谢物-细菌”对(用红色高亮显示，图5a-5d）的详细关系。表明：在这两项研究中，关键相关对的关联方向总体上是一致的。这些代谢物和微生物可能是改善健康的潜在靶点。然而，其潜在的生化机制仍不为人们所了解，应谨慎地将这些初步发现从动物研究中推演到人类身上。

  总结

  1、文章检测了42只雄性Wistar大鼠在7个时间点(第1、3、7、12、24、56和111周)的大脑代谢物和肠道微生物，并进行两级关联分析策略。  

  2、通过采用正则化典型相关分析(rCCA)、Spearman相关分析和线性判别分析(Lefse)鉴定了高水平的“代谢物型-细菌门”和较低水平的“代谢物-细菌”相关对。  

  3、通过对雄性大鼠的一项独立的饮食限制研究(n=12)进一步验证了关键对的有效性。