系统药理学和3-omics分析揭示了补肺益肾方BYF对COPD长期的疗效及机制

慢性阻塞性肺病(COPD)是一种炎性疾病，其特征在于进行性空气流量限制，并且被认为部分地由于响应于慢性空气污染物暴露(主要来自吸烟)而引起的夸大的肺部炎症。目前可用的治疗方法在很大程度上是无效的。因此，有效治疗COPD迫切需要新型的治疗药物。前期系统药理学鉴定了补肺益肾方(BYF)的195种潜在靶点，并被证实对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠有短期治疗作用。然而，对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的长期疗效及机制尚不清楚。因此，本研究以慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠为研究对象，于第9~20周给药。然后通过转录组学-蛋白质组学-代谢组学分析第32周BYF对慢性阻塞性肺病大鼠的长期影响。

  材料与方法

  样本收集  

  第0-8周构建COPD大鼠模型，将32只大鼠置于一个暴露于烟草和反复肺炎克雷伯菌感染的封闭的盒子里，第9-20周大鼠每日灌胃给予生理盐水(2mL)、BYF(4.44g/kg，0.5g/ml)和氨茶碱(2.3mg/kg)。

  检测方法  

  转录组：Microarray(4×44K)大鼠全基因组表达谱芯片；  

  蛋白组：8-plex iTRAQ，NanoLC-QTOF-MS；  

  代谢组：Agilent-1200 LC-Agilent-6520 Q-TOF；

  数据分析  

  Agilent GeneSpring GX software version 11.0  

  Mascot：蛋白质鉴定 

  Mass Hunter：代谢物鉴定 

  SIMCA-P：PLS-DA  

  基因、蛋白质和代谢物集富集、网络和通路分析

  Bingo(CytosCapev3.1.1插件)用于分析转录本和蛋白质的分子功能；DAVID和KEGG数据库对转录本和蛋白质进行途径富集分析。Metscape用于分析基因、蛋白质和代谢组学数据的整合途径；ClueGO(Cytoscape插件被用来探索基因和蛋白的分子功能。MetaboAnalyst 3.0被用来确定代谢物最相关的途径。

  结果与讨论

  BYF对慢性阻塞性肺疾病大鼠的呼吸检测  

  本研究以慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠为研究对象，研究了BYF对COPD大鼠的长期影响。建立吸烟和细菌感染所致慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型，并于第9~20周给予BYF治疗。于第0~32周进行肺功能评估，并于第32周进行病理组织学分析。

  如图1所示，与对照组相比，模型大鼠的潮气量(TV)、最大呼气流量(PEF)和50%潮气量呼气流量(EF50)从第4周至第32周明显下降，然而，这种下降被BYF和经典的支气管扩张剂氨茶碱(APL)所抑制。

  图1.BYF对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺功能的长期影响

  注：慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠灌胃给药4.44g/kg，第9~20周，每日1次。对照组用生理盐水治疗，阳性对照组用氨茶碱治疗(APL，2.3mg/kg)，每日一次。每4周检测一次潮气量(TV)(A)、呼气峰流量(PEF)(B)和50%潮气量呼气流量(EF 50)(C)。值表示平均值±SEM。*P<0.05与模型。

  BYF对慢性阻塞性肺疾病大鼠的组织病理检测 

  此外，模型大鼠肺损伤积分、细支气管壁厚度、小肺血管壁厚度、细支气管狭窄、肺泡内径均有明显增加，这可以通过BYF治疗得到显着的抑制作用(图2A-F)。此外，BYF治疗还显着增加了COPD大鼠的肺泡数(图2G)。这些数据表明，BYF治疗对COPD大鼠有长期治疗作用。

  图2.BYF对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织组织学变化的长期影响

  注：慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠灌胃给药，第9~20周每日1次，分别给予BYF(4.44g/kg)和氨茶碱(APL，2.3mg/kg)。第32周收集COPD大鼠肺组织。（A）组织学改变用H&E染色(原放大率×100)；(B)评估各组肺损伤评分；(C)支气管壁厚度；(D)细支气管狭窄；(E)肺小血管壁厚度；(F)肺泡数；(G)肺泡直径。数值表示平均值±SEM。*p<0.05，*p<0.01与模型。

  最近的数据显示，炎症与慢性阻塞性肺病患者的发病率和死亡率有关。先前的研究表明，在第20周，BYF治疗能有效地抑制COPD大鼠肺部的炎症反应。本研究测试了BYF对肺组织炎症介质表达的长期影响。如图3所示，COPD模型组大鼠中，IL-6、IL-1β、TNF-α和sTNFR2水平升高，并且这种增加收到BYF的显着抑制。这些结果表明，在第32周，BYF治疗能有效地抑制肺组织的炎症反应。

  图3.BYF对COPD大鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α和sTNFR2表达的长期影响

  注：慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠灌胃给药，第9~20周，每日1次，分别给予BYF(4.44g/kg)和氨茶碱(APL，2.3mg/kg)。(A)于第32周采用免疫组织化学方法检测肺组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α、可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)2的表达；(B)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织IL-6、IL-10、TNF-α和sTNFR2表达的定量分析。数值表示平均值±扫描电镜。*p<0.01与模型。

  先前的研究发现BYF能显着抑制20周时肺组织胶原沉积和蛋白酶-抗蛋白酶失衡。因此本文研究了BYF对肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1和胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ表达的长期影响。如图4所示，BYF显着降低MMP-2和MMP-9的表达水平并增加TIMP-1的表达。此外，在第32周，BYF还显着抑制胶原I、III的表达(图5)。这些结果表明，BYF在第32周可通过抑制胶原蛋白I，III，IV，MMP-2/9的表达，增加TIMP-1的表达来抑制胶原沉积和蛋白酶-抗蛋白酶失衡。

  图4.BYF对COPD大鼠肺组织MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的长期影响

  图5.BYF对COPD大鼠肺组织胶原蛋白I、III和IV表达的长期影响

  调节肺组织中转录组、蛋白质组和代谢体水平的分子

  通过大鼠全基因组表达谱芯片技术，检测到大约41000个基因。在这些数据集中，COPD模型(VS对照组)和BYF治疗(VS COPD模型)大鼠分别有1063和1106个差异调控基因。然后对这些差异基因进行了分子功能注释，发现这些基因可归因于各种分子功能，例如氧化还原酶活性、金属内肽酶活性、激素受体结合或NF-kappaB结合(图6A，B)。为了进一步分析，我们考虑了完整的数据集，以提取生物通路信息。此外，这些转录本被定位到许多不同的途径，如氧化磷酸化、粘着斑或泛素介导的蛋白水解途径。

  图6.COPD大鼠(A)和BYF治疗大鼠(B)肺组织调控基因的分子功能

  注：用ClueGO分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠(A)和BYF大鼠(B)调节基因的分子功能。功能分组网络，以条目作为节点连接，与功能相关的组部分重叠；节点大小表示功能条目富集的意义。每组只显示有意义条目的标签。

  用基于LC-MS的蛋白质组学数据分析，发现在COPD模型（VS对照）和BYF处理的大鼠（VS COPD模型）分别筛选到191和187个差异蛋白。同样对这些差异蛋白进行分子功能注释，发现这些调节蛋白的分子功能与氧化还原酶活性、过氧化还原酶活性或NAD结合有关（图7A、B）。此外，这些调节蛋白被定位到不同的途径，如ECM受体相互作用、焦点粘连、紧密连接和白细胞通过内皮细胞的迁移。

  为了进一步分析，COPD模型组(191种蛋白质)与BYF治疗组有132种共有蛋白质(187种蛋白质)。在132种蛋白中，70种蛋白在COPD模型中的表达被BYF抑制。这70个蛋白质的分子功能主要与氧化还原酶活性、抗氧化活性、细胞外基质结合和蛋白磷酸酶结合(图7C)有关，这可能是BYF的治疗机制。

  图7.慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织和BYF治疗大鼠肺组织调节蛋白的分子功能

  注：用ClueGO分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠(A)和BYF大鼠(B)调节蛋白的分子功能。功能分组网络，以条目作为节点连接，与功能相关的组部分重叠；节点大小表示功能条目富集的意义。(C)用BiNGO分析了慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠与BYF大鼠重叠蛋白的主要功能。

  最后，对代谢组学数据分析，发现在COPD模型（VS对照）和BYF治疗（VS COPD模型）大鼠中分别有41和32种差异代谢物，经MetaboAnalyst通路分析发现，发现这些代谢物主要参与花生四烯酸、亚油酸或谷胱甘肽的代谢（图8）。后面通过网络互作分析发现这些代谢异常主要与脂质代谢有关。

  图8.COPD大鼠(A)和BYF治疗大鼠(B)肺组织代谢物的通路分析

  注：用MetaboAnalyst分析最相关的途径。(A)COPD大鼠肺组织代谢物的典型途径分析。(B)BYF治疗大鼠肺组织代谢物的代表途径分析。

  基因、蛋白质和代谢物数据联合分析  

  通过构建相关网络图，初步应用Metscape软件检测代谢物、基因和蛋白质的潜在关系。在图9A，B中，利用COPD和BYF治疗大鼠的转录组学和代谢组学数据构建了这两个代谢物基因网络。结果表明，这些网络主要分为脂质代谢和能量代谢两类，其中大部分代谢产物和许多基因参与了脂质代谢。在图9C，D中，根据COPD和BYF大鼠的代谢物和蛋白质数据，构建了代谢产物-蛋白质网络。这些代谢产物-蛋白质网络主要由脂质代谢或谷胱甘肽代谢组成。有趣的是，本研究还发现超过一半的蛋白质和几乎所有的代谢产物都参与了脂质代谢。

  图9.COPD大鼠与BYF治疗大鼠肺组织中代谢物、基因和蛋白的互作网络

  注：利用Metscape构建了以化合物(六边形)和代谢酶(圆形)为节点，反应为边的复合反应网络。输入的基因和蛋白质用红色显示，输入的化合物用蓝色表示。(A)COPD模型组典型代谢物-基因网络。(B)BYF治疗组的典型代谢物-基因网络。(C)COPD模型组典型代谢物-蛋白质网络。(D)BYF治疗组的典型代谢物-蛋白质网络。

  系统药理学与各组学整合分析  

  将转录组学，蛋白质组学和代谢组学数据流与系统药理学目标数据相结合，以全面系统地了解BYF对COPD的长期治疗机制。

  分析发现，在BYF潜在靶点和BYF处理组大鼠的转录水平之间有8个重叠蛋白（katA, MAPK14, ACHE, ADRB1, CALM1, ADRA2B, ampC, gyrB），涉及分子功能主要有MAP激酶活性、肾上腺素能受体活性、乙酰胆碱酯酶活性、乙酰胆碱结合和细胞外基质结合（图10A）。在BYF潜在靶点和BYF处理组大鼠的蛋白水平之间有9个重叠蛋白（ampC, ATP5B, CALM1, COL1A2, gyrB, HSPA5, katA, SOD1 XDH），涉及的分子功能主要为氧化还原酶活性、抗氧化活性、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶活性（图10B）。

  图10.重叠蛋白的分子功能

  注：利用BiNGO分析了蛋白质的主要功能，并展示了结果直观、可定制的视觉表征。节点的面积与测试集中蛋白质的数量成正比。(A)BYF大鼠肺组织中潜在靶点与转录本之间重叠蛋白的代表分子功能。(B)BYF大鼠肺组织中潜在靶点与蛋白质组测量重叠蛋白的代表分子功能。

  最后，使用Metscape软件，通过构建相关网络，分析了调节BYF治疗大鼠的代谢物和靶蛋白之间的潜在关系，发现代谢物-靶蛋白网络主要由脂质代谢组成（图11）。

  图11.BYF治疗大鼠代谢物和靶蛋白的代谢相关网络

  注：利用Metscape构建了以化合物(六边形)和代谢酶(圆形)为节点，反应为边的复合反应网络。输入的化合物用蓝色表示，输入的靶蛋白用红色表示。

  通过以上综合分析，则为BYF治疗COPD的长期效应机制提供了的全面系统的解释。这些结果说明BYF通过调节多种生物学途径如脂质代谢、炎症反应、氧化应激、局灶性粘连途径对慢性阻塞性肺病有长期疗效（图12）。

  图12.BYF潜在靶点和治疗大鼠肺组织的转录组学、蛋白质组学和代谢组学的综合分析

  注：潜在靶标、转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据显示为不同颜色的矩形。红色箭头代表上调，蓝色箭头代表下调，灰色矩形表示无差异。

  总结  

  COPD和BYF治疗的大鼠中受调节的转录物、蛋白质和代谢物归因于多种分子功能，例如氧化还原酶活性、抗氧化活性和脂质代谢；且BYF可能通过调节脂质代谢、炎症反应、氧化应激和系统水平的局灶性粘连途径实现其对COPD的长期治疗作用。