编码和非编码RNA与蛋白结合鉴定

摘要  

  全转录组范围内鉴定能与蛋白结合的RNA（RBPs），是了解转录后基因调控网络的必要条件。然而RBPs蛋白组的研究主要局限于多聚腺苷酸的RNA与蛋白的结合，对于没有ploy-A尾的RNA（主要的是非编码RNA和RNA前体）几乎都没发现。本文介绍了一种点击化学（主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键（C-X-C）合成为基础的组合化学新方法，并借助这些反应（点击反应）来简单高效地获得分子多样性。）辅助的RNA互作捕获策略（CARIC），能够对RBPs进行无差别鉴定，不受RNA是否具有ploy-A尾的约束。CARIC主要是利用炔基尿苷类似物对RNA进行标记，并在活体内进行RNA-protein光照交联，然后与叠氮化物生物素进行点击化学反应，亲和富集后进行蛋白组分析。利用CARIC在人的宫颈癌细胞中鉴定到597个RBPs，包括130个之前未知的RBPs。这些新发现的RBPs可能是和非编码RNA结合的，因此发现了一些之前未知的非编码RNA参与的过程（例如蛋白酶体功能和中间代谢）。

  材料方法  

  实验材料：人的宫颈癌细胞，胚肾细胞；  

  质粒构建和细胞转染：克隆宫颈癌细胞cDNA（hnRNPC，MBNL1，VDAC1，NME2），克隆质粒：VigoFect；几种已知RPBs用来验证CARIC技术成功率  

  CARIC分离出的RNA测序：Illumina HisEq 4000 PE150；  

  蛋白质谱检测：LC-MS/MS，Easy nLC 1000 system +Velos Pro Orbitrap Elite mass spectrometer； 

  质谱数据分析：MaxQuant version 1.5.5.1（原始数据分析），依靠人的蛋白数据（UniProt）Andromeda search engine进行蛋白查询；  

  CARIC RBPs验证：CLIP（交联免疫沉淀）；  

  鉴定蛋白功能分析：等电点（ExPASy），密度分布曲线（MATLAB），蛋白结构域（Pfam），新陈代谢相关蛋白（Reactome）。

  实验流程 

  1、细胞内与蛋白结合的编码和非编码RNA（RPBs）首先用4SU（4-硫尿核苷）及EU（乙炔基尿苷）进行标记；2、365 nm UV光照射，使得4SU与RNA发生交联；3、细胞溶解后用铜催化的叠氮-炔烃环加成反应，再与标记到RNA上的EU发生交联；4、链霉亲和素磁珠富集标记了生物素的RPBs，用RNase处理这些RNPs（核蛋白颗粒），释放与RNA结合的蛋白，然后用LC-MS/MS对蛋白进行鉴定。

  研究结果

  1、CARIC实验的优化

  A.不同物质的紫外-可见光吸收光谱（365 nm紫外光只能激活4SU）；B/C.流式细胞仪分析结果表明EU和4SU同时标记的细胞数量是最多的；D.对添加不同剂量EU和4SU的细胞进行紫外照射评估被RNP含量（1Mm EU+0.5 Mm 4SU处理下，>130kDa RNP含量最高）；E.两种代谢标志物的添加对细胞的存活影响不明显。

  A．不同能量紫外光辐射下4SU和蛋白交联程度（2 J/cm2效果最好）B.紫外光照射对RNA降解的影响（2 J/cm2几乎不影响）C.几种不同催化剂配体评估对EU&4SU标记的效率（THPTA显著提高效率）D.0.5 Mm CuSO4标记效率最高；最优体系：1 mM EU+0.5 mM 4SU，2 J/cm2 UV，THPTA-CuAAC；

  2、CARIC捕获结果的验证

  A. EU和4SU不同标记组合下RNPs含量（只有EU+4SU能检测到）；B.链霉亲和素磁珠富集的标记后RPBs纯化产物，用RNase消化RNA之后，凝胶银染（WCL：全细胞溶解产物，IP：生物素免疫沉淀产物），EU和4SU双标条件下RPBs类型最丰富；C.WB检测CARIC捕获的几种蛋白（已知RPBs）的含量（表明CARIC能成功捕获RPBs）；D.磁珠富集蛋白纯化后用蛋白酶K消化，然后进行RNA测序分析结合蛋白的RNA类型及水平（除了rRNA、mRNA以外非编码RNA也比较多）。

  3.CARIC捕获RBPs的蛋白组鉴定（SILAC）

  利用稳定同位素标记方法对分别缺失4SU和UV处理的对照组与正常处理（CARIC）进行蛋白质谱鉴定比较。

  8个处理重复共定性到1271个蛋白，其中1210个被定量。

  1210个被定量的蛋白中，691个蛋白(adjusted P < 0.01)，正常处理和对照之间表达量差异在2倍以上的有597个RPBs，分为两类（ClassI>3=296，2）

  4.CARIC RBPs与人类已知RBPs进行比较

  B. CARIC RBPs GO富集注释（富集最多的是protein binding，最显著的是poly(A)RNA binding）；C. CARIC RBPs与人类已知poly（A）RPBs之间的重叠关系；

  D. CARIC RBPs与另外两种鉴定RBPs方法的比较；E. CARIC RBPs与两种RBP数据库的比较；F. CARIC RBPs与人类已知RBPs的重叠关系（130个是新发现）；

  5.CARIC RBPs中RNA-Binding Activity蛋白的验证

  A.五种代表性的RNA-Binding Activity蛋白在全细胞溶解液和IP中不同标记及是否消化RNA条件下WB检测结果（CARIC能够捕获RBPs，丰度与两种标记有关，RNase A处理能降低富集丰度表明这些蛋白是和RNA互作或者交联）；B.已知和未知RPBs用UV辐射交联FLAG或GFP，鉴定蛋白含量（已知RPB作为阳性对照）。

  6.CARIC RBPs等电点，结合结构域，RNA特异性结合

  A.人类所有蛋白及不同来源RBPs等电点分布；B/C/D/E.功能已知和未知RBP数量及功能分类统计，结合RNA类型及数量统计（主要是poly（A）RNA）；

  7.CARIC 鉴定到的新RBPs解析

  A.未知RBPs KEGG功能富集分析（其中一类比较富集的是“蛋白酶体”）；B. RBPs中不同类型的蛋白酶体，橙色：class I RBP，蓝色：class II RBP，灰色：假定CARIC RBPs；C.已知和未知RBPs中代谢酶数量；D.特殊代谢通路中CARIC RBPs数量；E. CARIC鉴定到的RBPs与人类孟德尔遗传数据库中RBPs重叠关系（未知的重叠蛋白有33个）

  这些和OMIM重叠的未知蛋白与多种疾病都是相关的

  研究亮点  

  1、传统RBPs蛋白组的研究主要局限于多聚腺苷酸的RNA，本研究利用点击化学辅助的RNA互作捕获策略（CARIC）克服了非编码RNA与蛋白结合鉴定的难题。  

  2、利用CARIC在人的宫颈癌细胞中鉴定到597个RBPs，与之前各种报道的RPB相比鉴定到130个之前未知的RBPs。并且利用WB，CLIP实验验证了部分未知RBP的准确性。针对鉴定到的RBP，分别利用SILAC和转录组测序，描述了蛋白的和RNA定性定量。

  参考文献  

  Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins[J].2018.PNAS