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综合转录-代谢组学分析揭示了收获草莓果实在短期内暴露于高浓度二氧化碳后的细胞反应

发布时间: 2019-03-07 19:10 来源:南京集思慧远生物科技有限公司

       发表期刊:Postharvest Biology and Technology  

  影响因子:IF=3.112(SCI二区)  

  研究背景  

  草莓(Fragaria×ananassa Duch.)由于其独特的风味和多汁的质地,是一种在世界范围内广受欢迎的园艺作物。它是维生素C和抗氧化剂的良好来源,但由于软化快、机械损坏、真菌腐烂和采后代谢迅速,很容易腐烂。在6℃贮藏1d后,草莓果实中的蔗糖水平由于快速的采后代谢而达到无法检测的水平。虽然草莓品种的贮藏期不同,但平均贮藏期通常只有3-5d。先前研究报道了CO2诱导的生理和机械变化,收获后,草莓果实中含有较高水平的二氧化碳(CO2)以提高可储存性。暴露于20%CO2中12或48h的草莓果实比在环境空气中贮藏3d的水果更结实。高浓度的二氧化碳会影响细胞壁钙的结合,提高果实的硬度。

  

  为了深入了解高浓度CO2在分子和生化水平上的影响,多学科方法是必要的。整合基因组学、蛋白质组学和代谢组学将有助于更好地理解植物对外界刺激的全面定性和定量反应。尽管对草莓果实采后对高CO2的响应进行了研究,但对细胞反应的全面了解仍不甚清楚。本研究联合转录组学和代谢组学方法来研究分子和细胞反应,将收获的草莓果实短期暴露于30%CO2,以全面了解改善的果实耐贮性。

  

  材料与方法  

  植物材料与CO2处理  

  草莓于80%红色收获,收获后,果实立即运往实验室。选择大小和颜色一致的果实作为试验材料。

  分组:  

  0D:环境空气0h(收获后立即)  

  1D:3h环境空气处理后1d 

  1DT:3h 30%CO2处理后1d

  

  硬度测定  

  随机抽取3个重复容器中的10个草莓果实进行硬度测定(n=30),经硬度测定后丢弃。采用CT-3纹理分析仪进行硬度测量。用直径为100mm、速度为2mm、应变为5mm、直径为100 mm的平板探针,在果实赤道面测量果实硬度(N)。

  

  草莓果实表面微生物测定  

  随机抽取3个重复容器中的1个草莓果实进行微生物分析(n=3)。用3M膜好氧计数板或3M膜酵母和霉菌计数板(3M)培养果实表面微生物,评价CO2的杀菌效果。

  

  不溶性果胶测定  

  采用细胞壁提取液进行不溶性果胶(insoluble pectin)测定。随机抽取3个重复容器中的1个果实进行检测(n=3)。用Multiple Plate Reader(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)在525nm处测定吸光度。

  

  透射电镜

  分别于3d和5d采摘新鲜草莓果实,将果实肩部切成1mm长的三角形,组织切成1-2mm厚的切片,进行透射电镜(TEM)观察。

  

  转录组学  

  检测平台:HiSeq 2500 PE250bp  

  生物信息学分析:CLC Genomics Workbench ver. 3.7.1;Trinity ver. 2.0.2;Velvet ver. 1.1.04;Oases ver. 0.1.21用于基因组装;Blast2GO ver. 2.6.5用于GO注释;KEGG以及Mapman 3.6.0用于差异基因功能注释。

  

  代谢组学  

  检测平台:GC-MS ISQ LT system 

  生物信息学分析:MetaboAnalyst 3.0用于树状图构建、热图聚类分析、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)以及及代谢途径分析。

  

 主要研究结果

  

  短期暴露于30%CO2可以减少水果腐烂  

  图1.草莓果实在25°C下30%CO2短期(3h)暴露对10°C贮藏期间果实品质的影响

  

  注:(a)贮藏后10d暴露于周围空气(对照,左)和30%CO2(处理,右)下的水果外观;(b)水果腐烂;(C)果实硬度。在贮藏后0h(采收后立即)、3h(贮藏3h后)、6h、12h、1d、3d、5d、7d和10d分别测定果实硬度。对于果实腐烂,数据是三个重复的均值±标准差。就果实硬度而言,数据是30个草莓果实的平均值±标准差(n=30)。

  

  30%CO2处理的草莓果实的灰霉病比周围空气处理的少(图1a)。对照果实在贮藏5d后开始腐烂,CO2处理减少了果实贮藏期间的腐烂。处理后10d,27%的对照果实腐烂,而CO2处理的果实只有19%腐烂(图1b)。为了评价CO2的抗菌效果,我们测定了对照表面的微生物数量,并对处理后3h后的果实样品进行了处理,两组结果无显著性差异。这证实了CO2处理的果实的减少的腐烂和可储存性的改善不是由于消毒效果,而是由果实中CO2处理诱导的细胞反应或CO2对胶束生长和孢子萌发的直接抑制作用。

  

  CO2处理还表现出果实在10℃贮藏期间软化的延迟(图1c),收获期果实硬度为10.25N,随着贮藏时间的延长,空气处理对照果实硬度为7.9N,CO2处理草莓果实硬度为9.16N。贮藏1d至10d,CO2处理与对照果实硬度差异显著,3、5d果实硬度最高。

  

  02.DEGs在细胞壁和次生代谢相关的途径中富集  

  图2 DEG数和DEG相关性

  

  注:(a)0D vs 1D,0D vs 1DT和1D vs 1DT样品的上调DEG的维恩图。(b)下调的DEGs的维恩图。(c)在0D与1D和0D与1DT之间共同上调的958个DEGs的Pearson相关系数。(d)在0D与1D和0D与1DT之间共同下调的1407个DEGs的Pearson相关系数。(e)在1D与1DT中RNA测序和qRT-PCR数据之间表达水平的Pearson相关系数。

  

  本研究对0D,1D和1DT草莓果实的转录组进行了进一步分析,以阐述草莓果实短期暴露于30%的CO2受到的细胞反应。GO分析结果显示,大多数(96%)被注释。0D vs 1D检测到3750个contigs差异表达(1643个上调,2107个下调)(图2a,b);1Dvs 1DT检测到958个上调基因和1407个下调基因。这些DEGs占0D与1DT的DEG的50%和0D与1D的DEG的63%(图2a,b),表达模式与较高的Pearson相关系数一致(图2c,d)。从1D和1DT之间的比较中特异性检测到的325个上调基因和216个下调基因用于研究30%CO2的影响。

  

  1D vs 1DT的DEGs的富集KEGG路径不同于0D vs 1DT的DEGs的KEGG路径,显示了30%CO2处理的效果,根据Fisher的精确测试,其中“嘧啶代谢”和“甘氨酰鞘脂生物合成”分别在上调的DEGs和在下调的DEGs中显著富集,具有最高的意义。大多数与“嘧啶代谢”和“单酰胺菌素生物合成”有关的结合物也与氨基酸生物合成有关,表明氨基酸代谢加速。此外,被下调的DEGS的“甘氨酰鞘脂合成”和其他富集途径表明,CO2处理对细胞壁相关代谢有很大的影响。另外,二氧化碳影响果糖、甘露糖、半乳糖和几种氨基酸的代谢。

  

  通过实时荧光定量(qRT-PCR)验证转录组谱。1D与1DT的15个DEGs表达水平在qRT-PCR结果中显示一致的表达变化,Pearson相关系数为0.8256(图2e)。

  

  03.30%CO2短期处理诱导细胞壁降解及HSP相关基因  

  

  

  图3草莓果实在25℃下30%CO2短期(3h)暴露对10℃贮藏过程中与贮藏相关的果实表达谱的影响

  

  注:分别对暴露于环境空气(对照)或30%CO2(处理)后储存在0h(收获后立即),3h(在没有储存的3h处理后立即),6h,12h,1d,3d,5d,7d和10d的果实进行qRT-PCR。每个基因的名称显示在图表的顶部。数据是3个草莓果实的平均值±标准偏差(n=3)。*,**和***分别代表p <0.05,0.01或0.001的显著差异。

  

  04.短期暴露于30%的CO2会改变蔗糖的代谢

  

  图4采后草莓果实GC-MS代谢产物的PLS-DA分析及载荷图

  

  注:(a)PLS-DA评分图和(b)载荷图是使用MetaboAnalyst 3.0创建。采用3个草莓果实(n=3)进行分析。

  

  用GC-MS对40种代谢产物进行检测和定量分析,确定CO2所致代谢变化之间的关系,并进行PLS-DA(图4)。第一和第二主成分占数据集方差的67%,但第一主成分(PC1)的样本分离最高,占方差的58.2%。在10℃贮藏期间,0D组、1D组和1DT组果实的代谢谱均发生了变化,并有明显的分离(图4a)。这与图中所示的结果是一致的,表明CO2处理对草莓果实的代谢状况有一定的影响。

  

  图4b显示了PLS-DA的负载代谢物在投射(VIP)评分中显示出可变的重要性。CO2处理果实中抗坏血酸和磷酸的浓度增加,这两种化合物是分离这两个类群的主要因素。细胞壁中的糖(如半乳糖、甘露糖、葡萄糖和果糖)的含量也随着CO2的暴露而变化。

  

  图5采后草莓果实GC-MS代谢产物图谱

  

  注:代谢物的颜色标度由PLS-DA的标准化数据计算。参与所示代谢谱的1D与1DT的DEGs用热图展示。根据颜色比例,左色块和右色块分别表示0D vs 1D和0D vs 1DT的每个contig的log2倍变化。

  

  在KEGG分析的基础上,将代谢物映射到一般代谢途径,说明了处理对代谢途径的影响(图5)。二十一种代谢物(肌醇,缬氨酸,果糖,甘油,木糖,抗坏血酸,硬脂酸,苹果酸,柠檬酸,天冬氨酸,苏氨酸,天冬酰胺,甘氨酸,丙氨酸,苏糖酸,谷氨酰胺,谷氨酸,葡萄糖,奎尼酸,琥珀酸和阿拉伯糖)在1DT样品中增加,葡萄糖,奎尼酸,琥珀酸和阿拉伯糖显著增加。细胞壁组分的前体阿拉伯糖(Arabinose)和莽草酸(Shikimicacid)的衍生物奎尼酸(Quinicacid)值得注意(图5)。此外,四种代谢物(蔗糖、甘露糖、半乳糖和焦谷氨酸)没有增加。

  

  根据其KEGG通路列出与代谢变化相关的候选DEGs(图5)。蔗糖的减少和葡萄糖和果糖的增加是代谢组学分析中观察到的最大变化,这部分地解释了转化酶抑制剂表达的变化。抗坏血酸脱氢酶的下调与抗坏血酸含量的增加有关。随着氨基酸水平(如谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸等)的变化,许多与氨基酸合成有关的基因被差异表达。

  

  05.短期暴露于30%的CO2可防止细胞壁超微结构的降解

  

  

  图6收获草莓果实的TEM图像

  

  注:图像显示:(A)暴露于空气中(对照)3d的样品;(B))暴露于空气中5d的样品;(C)暴露于30%的CO2(处理)3d的样品;(D)暴露于30%的CO2 5d的样品。缩写:CW,细胞壁;ML,中间层。

  

  为了检验所观察到的代谢变化的影响,我们用电子显微镜观察了果实的细胞壁。图6显示了草莓果实的细胞壁超微结构。3d后,对照(图6a)的中间层被分解和降解,并在贮藏5d时观察到细胞壁之间的空隙(图6b)。相反,在CO2处理的果实中,中层结构保持在3d(图6C),相邻细胞之间的细胞壁在5d时保持附着(图6d)。

  

  果胶是细胞壁的主要成分,果胶的降解是果实软化的主要原因。由于CO2处理的果实仍然结实(图1c),我们检测了细胞壁中不溶性果胶的多糖醛酸苷(Polyuronide,不溶性果胶)含量。贮藏过程中CO2处理果实中的多糖醛酸苷含量较高(图7)。3d后,对照和处理果实中多糖醛酸苷含量分别为18.3和29.6g kg-1。这些结果与果实硬度的结果一致(图1c)以及细胞壁降解酶的表达水平(图3a-c)。

  


  图7草莓果实在25℃下30%CO2短期暴露对10℃贮藏过程中不溶性果胶含量的影响

  

  注:在25℃下,水果暴露于环境空气(对照)或30%CO2(处理)3h。数据为3个草莓果实的均值±标准差(n=3)。*和*分别在p<0.05或0.01时有显著性差异。

  

  总结

  

  本研究记录了暴露于30%CO2处理3h后草莓果实中发生的转录组学和代谢组学变化。了解这种处理诱导的细胞反应和分子机制有助于改善或发展生态友好的采后技术,并提供基本知识,以识别对CO2高度响应的基因,从而培育具有更好耐贮性的草莓品种。


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