集思慧远客户发表《毛白杨叶片和茎尖分生组织中小RNA的鉴定与分析》

英文题目：Identification and Analysis of microRNAs in the SAM and Leaves of Populus tomentosa  

  杂志：Forests 

  影响因子：IF=1.956

  摘要 

  茎尖分生组织(SAM)是位于植物顶端的一种重要组织，可持续生长和分化、发育为地上部分。SAM的发育受到一系列复杂的分子调控网络的控制，其中microRNAs(miRNAs)及其靶基因起着关键作用。然而，人们对木本植物中的miRNAs知之甚少。本研究利用小RNA(Srna)测序技术，建立了毛白杨茎尖和成熟叶组织的4个文库，鉴定了99个已知的miRNA家族。此外，193种已知的miRNA，包括植物激素、发育和细胞过程相关的miRNA，表现出显著的差异表达。有趣的是，对miR172、miR164和miR 393的qPCR分析显示在茎尖发育过程中表达模式有显著变化。这些miRNAs的靶基因参与调节激素反应和干细胞功能。特别是参与维持茎尖干细胞的miR 172靶基因APETALA2(AP2)在发育的初始活动阶段就有特异性表达。这些发现对了解miRNAs参与SAM的发展和分化在树种中的调节机制提供了新的见解。

  材料与方法 

  植物材料:  毛白杨(20年)的健康茎尖和周围叶片.选择了以下三个发展阶段： 

  图中绿色框中组织表示用于qPCR测定的组织；蓝色框表示用于高通量测序的组织。

  方法：  

  形态观测：切片，显微镜观察  

  sRNA测序与分析：  

  测序平台：Illumina HiSeq 2500（IA时期每个样品2个重复，共4个文库；数据量平均每个文库12M）  

  分析：GenBank和Rfam数据库对sRNA进行分类注释  

  MIREAP预测新miRNA  

  表达量：TPM 

  靶基因预测：psRNATarget和psRobot  

  qPCR分析

  结果

  1..生长过程中茎尖和叶片形态和解剖结构的变化

  2.SAM和叶片中sRNAs的序列分析

  SAM和叶片数据过滤后的sRNAs的总体大小分布

  3、毛白杨中已知和novel-miRNAs的鉴定

  经过序列相似性搜索，确定了349个已知的miRNAs，它们对应于99个miRNA家族。在SAM中，328个已知的miRNAs被分成88个miRNA家族。此外，作者，还分析了已知miRNA家族中的reads数，结果表明这些miRNA家族在表达频率上存在很大差异，如下图所示。

  4、 差异miRNA（DEM）及其靶基因的分析

  作者对每一个样本中miRNA进行了量化，并筛选了在SAM和叶片之间显著表达的基因 (|log2 fold-change| > 1, FDR < 0.05）。

  图4 差异表达miRNA。（a）已知的和novel-miRNA的差异表达火山图；（b）SAM和叶片中已知和未知miRNA差异表达聚类图；（c）已知miRNA与叶片比较上调和下调的种类

  5、差异miRNA与茎细胞功能相关

  miRNA调解对激素响应起着重要作用。作者对靶基因为AP2、CUC2 , 和ATHB-15 的miRNA进行了分析。

  图5.差异表达miRNA及靶基因AP2（a，b）、CUC2 (c,d), and ATHB-15 (e,f）的热图和网络图。在热图中，颜色表示SAM和叶片中miRNA的log10TPM值。红色代表高表达，蓝色代表低表到，×代表不表达。

  6、miR172及其靶基因的表达

  以上分析内容显示，miR172在两组织中特异表达，作者做了该家族及其靶基因在SAM和叶片的三个时期的qPCR。

  图6 miRNA及其靶基因。（a）miR172在毛白杨AP2转录本上的靶位点及保守区域；红色框代表AP2/EREBP的两个保守域；（b-d）qPCR分析miRNA（b）及其靶基因的表达（c，d）。

  7、其他miRNA的qPCR验证

  为了验证从高通量测序中获得的miRNA的表达模式，作者用qPCR分析了10个已知miRNA和3个新miRNA来验证sRNA-seq的结果。

  图7.高通量测序所得miRNA表达的确认。

  讨论

  本文亮点在于对已有数据挖掘很到位，qPCR验证不仅对关注miRNA及其靶基因进行了验证，也进行了随机验证。但对于关键miRNA的验证工作文章只进行了qPCR验证作，如果有RNA-seq数据或者进一步进行功能验证，会更完整，也更有说服力。