摘要

      多年生树木在RNA水平的驯化和改良过程中的遗传变化研究一直不是很多。本文对具有代表性的野生、地方和改良梨品种进行RNA测序，并探索与驯化和改良相关的遗传信息变化。野生和地方种之间群体亲缘关系及核酸多样性都比较相近，而改良品种的核酸多样性显著的降低。在梨的驯化过程中共鉴定到11.13Mb基因组序列是受到选择清除的，而改良过程中鉴定到4.04Mb。野生组到地方组的受选择基因表达多样性降低了20.89%，而地方组到改良组恢复到23.13%，表明序列多样性变化表现出明显不同模式。模块性状关联分析鉴定到16个不同的共表达模块，其中6个模块是和重要的果实性状显著相关的。受选择区间候选的差异表达基因是和石细胞合成、果实大小、淀粉含量相关，其中一些能够比对到之前报道的QTLs位点。

材料方法

41种梨：14个野生种(PyW1-PyW14)，12个地方种(PyL1-PyL12)，15个改良种(PyI1-PyI15)（3个发育时期生物学重复）；野生梨P.

ussuriensis （成熟期）作为外群；共124个样。

转录组和表型关联分析：代表性的野生种（PyW12, PyW13, PyW14），地方种（PyL1,

PyL2, PyL3）的小果期，果实膨大期，成熟期。

RNA提取：100mg梨肉，测序方案：Illumina HiSeq 2500 PE125，平均8.11G。

参考基因组：砀山酥梨，野生比对效率76.91%，地方种77.80%，改良种78.20%。

差异基因筛选：RPKM，|log2FoldChange|>1 and FDR≤0.001。

PCA：基于表达量，R统计环境；对于SNP数据集，VCFtools、Plink收集数据，GCTA计算，画图：ggplot2。

系统发育树：SNPhylo，画图：FigTree v1.4.2。

群体多样性分析：π and FST，VCFtools v0.1.13（滑动窗口10kb，步移1kb）。受选择信号：top5%。

相关性（r2）：PopLDdecay（LD分析）。

基因共表达网络互作分析：WGCNA (v1.51)。

RT-PCR：LightCycler 480 SYBR GREEN I

Master (Roche)。

研究结果

1、所有品种梨的转录表达

果实大小和品质相比，改良>地方>野生；三组材料所有基因的表达变异系数相比，差异显著，表明改良、地方、野生群体之间基因表达模式差异明显。

B.PCA分析结果表明野生和改良种能区分开，而地方种与两组之间均有交叉且野生和地方种之间遗传背景更为相近。地方种PyL7-1与外源野生种距离很近可能是测序或采样错误造成。C.41个材料皮尔逊相关系数热图，每个材料的3个生物学重复之间相关性很高。

2、梨在驯化和改良过程中基因表达的差异

野生VS地方种差异表达基因共2118个，占总表达基因数据量的5.65%；地方VS改良种差异表达基因共3517个，占总表达基因数据量的9.38%；野生VS改良种差异表达基因共3695个，占总表达基因数据量的9.86%。

3、群体关系、多样性和连锁不平衡分析

基于SNP信息进行41种梨的PCA及系统进化分析，结果与基于表达量分析结果相似。

群结构分析表明改良种遗传背景比野生和地方种要更杂，原因可能是品种改良过程中的杂交引入的。

三组梨之间野生型核酸多样性最高，改良种最低（A/C），野生-改良之间Fst最大，野生-地方之间Fst最小（B/C）；野生种的r2和衰减聚类都是最短（D）；说明人类对地方种驯化过程的干预要小于改良过程。

4、驯化和改良过程中选择性清除信号

A/B.驯化和改良过程受选择区域分析（top5%）；C.受选择的窗口数量及对应基因数量；D.驯化和改良过程受选择基因表达变异系数（长期驯化导致了地方种基因表达多样性下降，在改良过程中又得到恢复并提高）

驯化过程受选择基因（996），改良过程受选择基因（301）在梨基因组上的分布情况。

驯化和改良受选择基因中分别有72和22个是差异表达的。

5、动态转录组和网络共表达分析

各挑选3个代表性野生和地方材料3个果实发育时期2905个差异基因能够划分为16个共表达模块，其中有6个表达模块和一种或者两种果实性状强相关。

3个代表性野生和地方材料3个果实发育时期（a），在发育阶段基于基因的表达特征是能够区分开的（b），随着果实的成熟，野生和地方种的差异基因都是在逐步降低，同时下调基因也高于上调基因。

6、果实品质相关模块功能分析

石细胞和果实大小发育生物合成途径

木质素合成与氨基酸合成密切相关，之前功能研究表明Pbr000691.1，Pbr041997.1分别是编码CAD（肉桂酸脱氢酶）和POD（过氧化酶）的基因。这两个基因在小果期是显著差异表达的，野生种表达量高于地方种。

生长素是调控细胞生长的重要激素，Pbr023270.1 （SAUR）参与生长素合成途径，Pbr009069.1，Pbr009070.1注释为SHY2/IAA3（生长素响应蛋白），在地方种发育的各时期均高表达。

定量实验结果表明Pbr009070.1在地方种中高表达，Pbr023270.1，Pbr009069.1不表达。

7、性状相关QTL验证了选择性清除区域性状相关基因

前期研究文献报道的与果实大小、含糖量、石细胞相关的QTL位点，以及选择清除区域挑选的差异基因在染色体上分布有大量的重叠。98个差异基因与28个QTLs重合。

8个与三种性状相关QTL重叠，在野生和地方种中进行RT-PCR分析，表达趋势与RNA-seq相似。

研究亮点

1、转录水平针对野生，地方，改良种的梨进行群体结构和遗传进化分析，强调了不同组群材料的基因表达模式的差异，分别利用基因表达量和SNP信息对三个组群进行分析，得到相似分离结果。野生和改良种能区分开，而地方种与两组之间均有交叉且野生和地方种之间遗传背景更为相近。

2、选择性清除分析区域内基因功能注释，差异表达分析与果实大小，石细胞，含糖量等多种性状相关。并且与已报到的定位区间存在高度重叠，针对8对差异表达的候选基因进行定量验证。

3、针对挑选的代表性野生种和地方种进行基因的动态表达分析及共表达模块分析鉴定到6个表达模块与果实的不同性状相关。

4、针对石细胞和果实大小发育代谢通路进行描述，并挑选通路中的候选基因进行定量验证。