Fluidigm单细胞外显子组测序帮助乳腺癌治疗

为乳腺癌治疗系一条粉红丝带

——单细胞外显子组测序揭示出细胞群体的深入见解，将帮助找到更好的治疗方案

美国国立卫生研究院（NIH）的评估结果表明约有八分之一的女性将在生命中被诊断出患有乳腺癌。这些统计数据令人触目惊心。目前乳房已成为女性最频发癌症的部位，而在此形成的乳腺癌也成为导致全世界女性患癌死亡的首要原因。癌细胞无限增殖的特性使得恶性肿瘤往往含有多种不同基因型的细胞亚群（肿瘤异质性）。由于不同类型的细胞将会对治疗产生不同应答，所以阐明细胞与细胞之间的不同就成为准确制定出针对每位病患最行之有效用药方案的关键。

来自蒙特利尔麦吉尔大学（McGill University）和魁北克基因创新中心（Génome Québec Innovation Centre ,MUGQIC）的JiannisRagoussis博士是乳腺癌研究领域最早实现单细胞全外显子组测序的科学家之一。长久以来，希腊人都以开拓者的形象闻名于世，Ragoussis博士也不例外，早在2013年他加入魁北克基因创新中心（MUGQIC）之前，就已经在牛津大学的人类遗传学威康信托中心（Wellcome Trust Centre for Human Genetics）做了11年研究，将已有的基因组学平台发展成果与新引进的二代测序技术进行了有机结合。

智能测序

在魁北克基因创新中心，Ragoussis博士率先采用Fluidigm的 C1系统制备单细胞全外显子组测序样本使二代测序达到了单个细胞测序的分辨率。他开创性地根据细胞多样性进行分类将癌症的识别和消灭工作分成两个项目进行，并且从最变幻莫测的乳腺癌开始研究。他的研究小组主要研究三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer），这是恶性程度最高的乳腺癌亚型之一，主要特点是预后很容易转移和复发。由于缺乏表达雌激素、黄体酮和人表皮生长因子-2（HER2/neu）的受体，三阴性乳腺癌对标准的激素疗法不敏感。传统治疗方法都只能针对这些受体中的一种进行治疗，所以三阴性乳腺癌的病例往往颇具挑战性。

单细胞全外显子组测序技术提供了一个独特的视角来进行癌细胞生物学研究，这是细胞群体样本测序方法无法提供的。利用这一独特的视角，Ragoussis博士得以在癌症发生以及进行治疗的过程中对个体细胞群的突变谱（mutational profiles）进行描述，并且可以追踪它们随时间是如何变化的。

单细胞全外显子组测序技术对于攻克难治性（treatment-resistant）三阴性乳腺癌来说非常重要，Ragoussis博士说：“突变谱分析可以提供那些在治疗后积累并促使癌细胞存活下来的变异信息。”

充满希望的预实验

在早期使用C1系统新流程的的一次实验中，Ragoussis博士采用单细胞全外显子组测序技术来检验个体细胞群的异质性。他解释了项目进行到此阶段的两个整体的目标，“通过增加新的有意义的药物靶标来扩充可能的药物化合物库，同时最大限度利用目前已有的化合物。”

Ragoussis博士的研究小组首先致力于将细胞们按照各自的突变谱进行分组，这样可以帮助他们确认究竟存在多少种不同类别的突变谱以及评价是否可以将突变基因归类到可提供致瘤线索的相关的网络中。他补充说“先理解肿瘤细胞的异质性以及肿瘤细胞在体外如何应答对于预测什么物质可能在体内有效是十分重要的。”

在近期的一项预试验中，Ragoussis博士和同事们验证了这个工作流程并且确认C1系统可以整合到他们已有的快速捕获实验流程中。Ragoussis博士说：“Fluidigm的工作流程是迄今我们应用的最令人振奋的技术成果之一。预试验证明了这种方法在我们研究中的高效性和可行性。”

采用新的工作流程产生了可靠的统计数据，Ragoussis博士估计大约覆盖了70% 细胞的全外显子组。他的结论是：“这些数据与传统的细胞群体测序法所产生的数据是有可比性的。”

Ragoussis博士是与麦克吉尔大学Goodman癌症研究中心（Goodman Cancer Research Centre）的主管Morag Park一起合作研究的。Morag Park的实验室通过外科手术创造出不同物种间组织移植的样本，或者是在小鼠体内产生原发性乳腺癌的异种移植物。移植后这些癌细胞继续保持原始肿瘤的复杂性进行生长。

在用培养基培养异种移植物细胞后，研究小组利用C1系统进行单细胞捕获从而对全外显子组进行测序。迄今为止，科研人员们已经对来自一个难治性肿瘤中的81个单细胞进行了分类。

目前Ragoussis博士和他的研究小组已经识别出肿瘤中所有的体细胞突变，他们正利用这些信息来定义错误发生率（false discovery rate）以及确定一个特殊的突变在被界定成为真正具有统计学意义的发现时需要被检测到的次数。

接下来，科研人员们计划利用单细胞外显子组测序技术来阐明难治性产生的机制。Ragoussis博士希望结合单细胞全外显子组测序的数据和已有的蛋白表达数据集创建出能够分析体外治疗效果的试验方法。从理论上来说这种方法可以帮助我们找到针对不同癌细胞类型患者的行之有效的个性化治疗方案。

全外显子组测序“将成为必要条件之一”

第二个项目由Ragoussis博士与麦吉尔大学的Richard Kremer来合作完成。在此项目中Ragoussis博士检测了血液循环中肿瘤细胞分子层面的信息。与肿瘤检查一样，这种被称为“液态的活体组织切片”中也充满了各式各样的癌细胞，通过它可以实时地评估患者当下的病情，而且评估结果比影像学方法更加精确，与传统的活体组织切片法相比也是一种微创的方法。由于血液样本容易获得，我们就可以在治疗前后对肿瘤细胞的情况都进行监控。“这可以帮助我们预测转移行为，也可以使我们看到一种治疗方案能否消灭某个特别危险的细胞群，” Ragoussis博士解释道，“我们最终的目标是实现个体化用药，到那个时候患有难治性癌症的病人能够通过循环肿瘤细胞分析找到最能抵御疾病的特殊药物。”

Ragoussis博士说：“尽管目前仍处于研究早期，但是我们可以很清晰的看到单细胞的分辨率比细胞群体实验所显现出的结果涵盖了范围更广的发散度，使我们看得更加精细。如果我们想阐明细胞的转录编程机制，全外显子组测序将成为突变分析的必要条件之一。

Ragoussis博士和他的同事们正在筹划组织来自MUGQIC 的250名研究人员融合新的基因组学方法和生物信息学开发可以广泛应用于医疗领域的新技术。

他说：“我们的使命就是建立基因组学研究方法并使它们得到广泛应用。这些相似的单细胞测序方法几乎可以为我们研究所有疾病提供启示。”