三种长片段测序方法对比

近期，由澳洲昆士兰大学发表在bioRxiv的文章《Comparison of long read methods for sequencing and assembly of a plant genome》中，采用三种长片段测序技术Pacific Biosciences (Sequel I), Oxford Nanopore (PromethION、MinION) 和华大智造stLFR(single-tube Long Fragment Read)对夏威夷果（Macadamia jansenii）进行了基因组组装，并分别从组装结果的准确度、完整度、测序成本及样本要求等四个方面进行了对比。

文库构建和上机测序

采用15ug DNA 构建30Kb以上的文库用于PacBio测序，并将该文库用sequel I测序8个SMRT cell，得到317万条subreads，总数据量为65.2Gb，N50为35.9Kb。

基于ONT平台构建文库的DNA投入量为1.5ug和1.2ug，将其文库分别在PromethION和MinION测序，得到的下机数据分别为23.2Gb和1.7Gb，reads的N50分别是28.5Kb和16.6Kb。

华大智造stLFR文库构建从10 ng DNA稀释液中提取1.5ng用于后续建库，然后采用MGISEQ-2000RS进行测序，得到约74.5Gb的数据用于后续组装。

对比上述三种长片段组装方法可知，stLFR文库组装所需投入量远低于PacBio及ONT，仅需要1.5ng即可。同时，根据表1可知，基于华大智造DNBSEQ平台的测序成本最低，不到PacBio的十分之一。

表1 测序数据统计

数据处理和分析

在对下机数据做接头和低质量过滤后，分别得到25Gb (ONT)、65Gb (PacBio)、74Gb (MGI)数据用于后续分析。设置k-mer为21-，23-和25-对基因组大小进行评估，已知夏威夷果的基因组大小约为616-653Mb。

分别用Redbean v2.5、Flye v2.5、Canu v1.8和Raven对ONT数据进行组装。结果显示Canu 和Flye能得到更大的基因组和更多的contig数，其次是Redbean (~750 Mb, contig N50 ~700 kb)和Raven (~720Mb, contig N50 ~500 kb) 。Canu在32X的contigN50为1.43Mb，远远大于21x下的706Kb。Flye的运算速度比Canu快5倍。

用Redbean、Flye、Canu及Falcon对PacBio数据进行组装，结果显示Falcon结果最好，contig N50为1.38Mb，Redbean的组装结果最分散，完整度只有89%。Flye的组装结果更接近Falcon，但是基因组大小只有767Mb，Canu的重复序列比例太高，组装的基因组达到1.2Gb。

使用superNova 2.0对stLFR进行组装，得到752 Mb 的基因组，contig N50为 35.6 kb，scaffold N50 为3.54 Mb，BUSCO评估基因组完整度为88.3%，组装结果的mismatch和Indel最少，准确性最高。

表2 基因组组装结果

注：表中的BGI即代表采用了基于华大智造DNBSEQ平台的stLFR技术得到的组装结果。

进一步地，如果使用ONT数据对组装结果进行“补洞”，则contig N50 可以从35.6Kb提升到1.05Mb，最长的contig从518 kb 提升到9.7 Mb，gap数从24,933 降低到2,284，基因组完整性也提高了4.8%，达到了92.5%。

表3 用ONT数据对stLFR组装结果进行“补洞”

组装结果比较

用QUAST v5.0.2对组装结果进行评估，并与已发表的夏威夷果基因组进行比较。为了评估碱基的准确度，用QUAST计算组装结果里的mismatch和InDel比例，结果显示：基于华大智造stLFR技术的mismatch和InDel均是最低的，组装结果具有最高的准确性；ONT组装结果在校正前后有明显的差异。

图1  组装结果碱基准确性比较

用BUSCO对各版本组装结果进行完整性评估，采用的数据集为eudicotyledons_odb10 (2121 genes)。结果显示：ONT+Illumina、PacBio以及stLFR+ONT三种方法的完整性无明显差异，均达到92%以上。

图2 组装完成性评估

讨论与结论

通过对比分析，Pacific Biosciences (Sequel I), Oxford Nanopore (PromethION) 和华大智造MGI stLFR三种长片段测序技术都能得到非常好的组装效果。相对而言，华大智造stLFR技术所需投入量最低，仅为纳克级别，并且组装结果的mismatch和InDel最低，准确度最高，特别适用珍贵样本或极端样本检测，同时测序成本上具有显著优势。

参考文献：

Comparison of long read methods for sequencing and assembly of a plant genome.

doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992933