Nature Protocol：i-GONAD技术简介 CUY21EDITⅡ电转仪原位递送RNPs至受精卵制备CRISPR基因编辑工程小鼠

Nature Protocol：i-GONAD技术简介

CUY21EDIT Ⅱ电转仪原位递送RNPs至受精卵制备CRISPR基因编辑工程小鼠

        创建基因工程小鼠的传统方法包括三个主要步骤：1. 从一组雌性动物中收获胚胎，2. 将试剂微注射到离体胚胎中，3. 然后通过外科手术将其转移到另一组雌性动物中，尽管繁琐，但这些方法已经使用了三十多年。研究者最近开发了一种名为GONAD的方法（genome editing via oviductal nucleic acids delivery），该方法绕开了这些步骤。GONAD技术将将CRISPR成分（Cas9 mRNA和guide RNA（gRNA））注入孕后1.5d孕鼠的输卵管，通过CUY21EDITⅡ电转仪，在体内电穿孔将这些核酸组分原位递送到受精卵中，使用GONAD证明了靶基因可以在小鼠胚胎发育的不同阶段被破坏和分析。
        现在，研究者开发了改良版GONAD（i-GONAD）。 通过CUY21EDITⅡ电转仪导入CRISPR RNPs（RNPs： Cas9蛋白/Cpf1蛋白 + gRNA）进入第0.7天孕鼠体内，使其适合常规基因导入，提供单链DNA（ssDNA）修复模板后，i-GONAD还可以生成包含多达1kb插入片段的敲入模型，基因编辑效率更高。i-GONAD还具有其他优势：不需要切除输卵管或子宫，使用i-GONAD的雌鼠不会被处死，还可以用于其他实验，掌握小动物手术的研究人员在没有精密显微注射设备的实验室中就能轻松进行，高效同时也节省成本。

        这个protocol提供了建立GONAD方法的分步方案，该方案需要约6周的时间来生成G0代基因工程小鼠。

        整个i-GONAD技术的流程中不需要精密的显微注射步骤，需要的仪器仅为体式显微镜（Olympus, model no. SZ11)）和CUY21EDITⅡ电转仪，以及一些常用的手术器械。

        关键的电转步骤如图所示

        上图显示体内电转的示意图（步骤22–26）。a. 用一块湿的Kimwipe毛巾覆盖输卵管。b. 将电极浸入灭菌PBS中。c.将电极放置在被Kimwipe覆盖的输卵管上，以抓住组织，使用CUY21EDITⅡ电转仪进行电转（ 左）和输卵管的电转（右）。d. 最好用蘸有70％（vol/vol）乙醇的棉布擦拭电极的内表面，以清洁后再用于输卵管。

        在不同的实验条件下，对8至10周龄的C57BL / 6J雌性小鼠进行实验，使用CUY21Edit II电转仪进行100 mA电转的i-GONAD，实验观察到100 mA电流在C57BL / 6小鼠品系中产生最一致和最佳的结果，在这种电穿孔条件下，在Tyr locus中获得了96％的indel突变效率。 电流200mA以上的时候基因编辑效率高达100%，但是小鼠胚胎数量会变少，因此作者推荐大部分小鼠品系选择电流的时候选择50-200mA区间范围（50mA，100mA，150mA，200mA）。

        Nature Protocol中电转条件为CUY21Edit II: square (mA), (+/−), Pd V (voltage of the pulses): 60 V or 80 V, Pd A (current of the pulses): 100–150 mA, Pd on: 5.00 ms, Pd off: 50 ms, Pd N (pulse cycle): 3, decay: 10%, decaytype: Log

        GONAD后植入前小鼠胚胎中的荧光。（a）-（c）从MCH（ICR）雌性收集的两细胞胚胎，在注射溶液后进行i-GONAD实验流程，含有四甲基罗丹明标记的葡聚糖3kDa（红色），EGFP mRNA（绿色），注意观察到的胚胎既有红色也有绿色，（d）至（f）为从MCH（ICR）雌性收集的两细胞胚胎经过类似处理的对照组实验结果 。可以观察到CUY21Edit II电转效率非常高。

CUY21EDITⅡ电转仪：

・通过该仪器实现了精确的矩形波和双脉冲衰减脉冲波输出

・可以用于体内和体外实验的真正的电基因转移装置

・业界第一款恒流脉冲输出

・恒定电流脉冲非常适合诸如GONAD之类的体内电转

・出色的触摸屏操作性

・记录所有输出脉冲的执行电压和电流值

・输出脉冲记录可以导出到USB存储器

        在电转实验中，电穿孔造成细胞损坏程度主要取决于电流大小，电流值决定电穿孔的成败。

        示例）在镊子型电极之间夹有样品（卵形管）时即使电压相同，根据电极之间的距离和电极的状态（氧化等），流过的电流也不同。

        CUY21 EDIT II能够实时检测电阻，控制电压，产生恒流的电流脉冲输出。换句话说，将输卵管夹在镊子型电极之间的GONAD实验中，即使各实验之间的夹持力不同，电流依然保持恒定值。在多种具有许多参数变量的体内电穿孔，可以保持电参数固定，带给您更好的实验重复性和更高的基因导入/编辑效率。

        CUY21 EDIT II电转仪满足所有活体电转，原代细胞（如原代神经元），贴壁细胞，难转染细胞等的高效基因转化电转过程无需特殊溶液，为您节省成本，减少操作，提升效率。

文献来源：

Nat Protoc. 2019 Aug;14(8):2452-2482. doi: 10.1038/s41596-019-0187-x.