Western Blot实验的进化：从管家蛋白到总蛋白归一化

Western Blot实验的进化：从管家蛋白到总蛋白归一化

 自1979年首次发表以来，Western Blot（WB）实验一直是测定复杂生物样品中蛋白质相对表达的一项关键技术。随着实验技术的发展和技术的进步，文章发表越来越注重标准化和数据的可重复性。归一化是WB实验中重要的内部控制过程，通过简单的数学运算，降低泳道之间和样品之间难以避免的上样差异。通常WB实验的内参为不受实验影响的内源性蛋白。将内参蛋白作为上样浓度的指标。

大部分WB实验都使用管家蛋白（Housekeeping proteins）作为内参蛋白，通常使用的管家蛋白为：肌动蛋白（如：β-actin），微管蛋白（如：α-tubulin），3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。通常，这些管家蛋白在细胞和组织中高度表达，但是管家蛋白在实验中也经常受到病理条件和实验条件的影响。例如，细胞汇合度（Cell Confluence），上样蛋白总量和细胞/组织类型都有可能影响看家蛋白的表达水平。例如，NIH3T3成纤维细胞中细胞汇合度从10%增加到100%的过程中（细胞瓶长满的过程），α-tubulin和GAPDH表达明显增加。WB实验在较大的总蛋白量上样量条件下，β-actin的一抗会无法检测蛋白含量变化。不同的研究如果使用的看家蛋白不一致，很难进行相互之间的比较，数据分析和解释也会不准确。如果研究人员希望使用看家蛋白作为归一化方式，还需要验证这个看家蛋白不受实验条件的影响。因此一种不受实验条件影响的，统一的归一化方法显得非常有必要。

总蛋白归一化（Total protein normalization）是目前最可靠的WB实验蛋白归一化方法。总蛋白归一化在灵敏度，可重复性方面均优于看家蛋白实验方式，研究者需要荧光成像系统和荧光染料标记的二抗，就可以进行总蛋白归一化精确定量上样蛋白。一般来说，总蛋白归一化适合高表达量和低表达量的目的蛋白检测，常见的看家蛋白仅仅适合高表达量的目的蛋白检测。如果一定要使用看家蛋白进行WB实验，现在的期刊要求研究者：1）测定看家蛋白和目的蛋白的线性范围，2）在不同的实验条件下证明看家蛋白不受到实验条件影响，3）补充信息验证一抗的特异性，或者建议至少使用两种看家蛋白，一种表达量高，一种表达量低，作为内参进行归一化。由于实验课题通常包含多个目的蛋白的检测，多次重复看家蛋白的标准曲线会增加相当大的工作量，因此使用蛋白归一化可以减少工作量，节约研究者宝贵的时间。

图1. 证实了β-actin和β-tubulin在病理组织中表达改变。 SMA脊髓提取物中检测肌动蛋白和微管蛋白。 A.绿色（42 kDa）的β-actin条带与总蛋白染色的凝胶（红色）重叠。 B.以总蛋白染色的凝胶（红色）覆盖绿色（60 kDa）的β-tubulin条带。 C.当比较SMA小鼠（SMA）与野生型对照（WT）时，β-actin（黑色条）和β-tubulin（灰色条）的表达水平的百分比变化的定量结果。 总蛋白染色（白条）用作对照。

很多文章将总蛋白归一化与常见的看家蛋白进行比较，证明了在定量WB实验中，相同的上样量条件下，常见的看家蛋白会在组织中差异表达。例如，在脊髓性肌萎缩症小鼠模型中，与健康野生小鼠相比，疾病组β-actin和β-tubulin在脊髓组织中的表达量都会减少，β-actin表达降低了19.3±2%，β-tubulin表达降低了7.3±0.5%。如果使用了β-actin作为WB实验的看家蛋白作为内参，WB的定量实验数据结果可能偏离了20%。看家蛋白作为上样内参（Loading control）的时候，线性范围非常窄，极大的限制了研究者的实验设计，难以满足WB实验的定量需求。

图3. 蛋白质稀释系列的定量显示β-actin（黑色圆圈）和β-tubulin（空心三角形）的线性范围。 β-tubulin的线性范围<10μg。

看家蛋白的表达差异不仅存在于神经系统中，在骨骼、脂肪和内部器官在内的多种组织中，都能检测到看家蛋白的表达差异。实验结果显示，在心脏和脾脏组织之间观察到了β-actin表达差异最为明显。在几乎相同的蛋白上样量的实验条件下，β-actin表达量出现了明显的差异表达，如果这些实验均使用β-actin作为看家蛋白归一化，引入的误差可能相差20%以上。因此，研究结果和期刊杂志都建议使用总蛋白表达量作为蛋白上样量的指标，从而对多种组织和实验中的表达结果进行比较和分析。

图2. β-actin表达的比较分析在广泛的组织中变化很大。A.评估β-actin表达的组织样品的代表性图像。 从左到右：肌肉（腓肠肌），心脏，骨骼（股骨），颅骨，脾脏和脂肪（性腺）。 比例尺= 1 cm。 B. 定量WB实验显示了肌肉，心脏，骨骼，颅骨，脾脏和脂肪提取物中的β-肌动蛋白表达（绿色）存在很大差异。 总蛋白染色凝胶图像（红色）覆盖在作为对照。 C.对于不同分子量范围的总蛋白质测量结果表明，在不同组织样品中蛋白质上样的准确性。 D.堆叠的条形图，显示了所检查的每个组织的β-actin（绿色条）和总蛋白质测量值（红色条）的比较变异性。

图4. （左图）AzureRed与三种目标蛋白质同时成像。 在Azure成像系统上成像。 （右图）与普通管家蛋白相比，AzureRed具有更宽的线性动态范围。

Azure Biosystem公司的AzureRed总蛋白染色，对Western Blot实验流程造成最小干扰的情况下，研究者可以轻松地对总蛋白进行染色和归一化。在定量检测WB实验中，明显优于常规的看家蛋白，高重复性，宽动态范围，使得AzureRed总蛋白染色非常适合研究人员进行中蛋白归一化。

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一致—AzureRed发出的信号可再现，不受组织类型和实验条件的影响
准确—AzureRed在宽动态范围（> 3 logs）内呈线性，可实现可靠的定量
灵活— AzureRed可与荧光标记的抗体以及化学发光检测系统一起使用

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