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质谱流式检测技术(CyTOF):新一代肿瘤免疫学研究工具

发布时间: 2020-06-23 13:40 来源:深圳市恩科生物科技有限公司

质谱流式检测技术(CyTOF):新一代肿瘤免疫学研究工具

 

癌症的免疫疗法正在彻底改变肿瘤学。免疫检查点阻断剂在很多晚期和转移性实体瘤中实现了长期的有效性,这些都使得癌症免疫疗法在基础医学、转化医学和临床医学领域产生了巨大的影响。然而,在癌症免疫学领域仍有很多重大挑战,包括阐明免疫检查点阻滞剂耐药的机制,确定应答的预测标志物,确定具有协同潜力的联合疗法,以及确定 CAR-T 细胞进行治疗的靶标。

肿瘤系统和免疫系统在机体中相互交织,高度的复杂性对研究者是相当大的挑战。在研究过程中需要使用更全面的方法来评估肿瘤发生发展的过程和这个过程中伴随的免疫系统变化。高通量高维度的数据结果能加深我们对肿瘤免疫方面的理解,最终使肿瘤免疫疗法的患者收益。单细胞测序和质谱流式技术(mass cytometry by time of flight: CyTOF)首次实现了单细胞层面上分子行为的精确表征,为了处理,分析和可视化这些技术生成的多维数据结果,需要使用特殊的计算方法和相应的软件工具。 在这里,我们回顾用于评估癌症免疫力的计算工具,讨论了各种方法的优缺点,并提供了指导方法选择的指南。

肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用已经被概念化,称为癌症-免疫周期。研究者需要使用多个方面来评估肿瘤免疫相互作用,为癌症免疫治疗提供依据。肿瘤免疫的全面表征包括以下几个方面:新抗原(neoantigens),免疫状况(immune contexture),肿瘤微环境(TME)以及宿主和环境因素。

图 1. 在肿瘤微环境中,垂死的癌细胞释放的新抗原被树突状细胞捕获以进行处理。 归巢淋巴结后,树突状细胞将捕获的新抗原呈递给 T 细胞,诱导其启动,激活和克隆扩增。 活化的 T 细胞迁移到肿瘤微环境中,在那里它们通过分泌诸如颗粒酶 B(GZMB)和干扰素-γ(IFNγ)等分子而发挥抗癌免疫反应。

图 2. 肿瘤免疫微环境的三个方面决定了癌症患者对免疫疗法反应的可能性:1. 免疫浸润组成,是效应性细胞还是抑制性细胞; 2. 免疫细胞的局部定位,效应细胞是否可以浸润到肿瘤核心,或者局限在肿瘤边缘(免疫排斥型)甚至在肿瘤中不存在(免疫沙漠型);3. 效应细胞的功能,是功能性的 T 细胞还是功能失调的 T 细胞。

图 3. 肿瘤微环境是一个复杂的生态系统,由不同类型的细胞组成,包括:癌细胞,上皮细胞,癌症相关成纤维细胞(CAF)和免疫细胞,例如细胞毒性 T 细胞,调节性 T(Treg)细胞和髓样抑制细胞(MDSC)。

图 4. 除了肿瘤的免疫情况外,患者不同的个体情况也会影响治疗结果以及对治疗的反应,这些因素包括慢性病毒感染,局部微生物群,宿主的免疫状态,免疫调节药物和循环细胞因子。

常规 RNA 测序(RNA-seq)数据仅能重建混合细胞群体的平均转录组,而单细胞 RNA 测序技术(scRNA-seq)可用于重建单个细胞的转录组,为研究异质性、可塑性和免疫系统的功能多样性提供了新途径。单细胞分离技术大多数基于孔板或微流控的方法。Smart-seq2 通过荧光激活细胞分选(FACS)将细胞分选到孔板的孔中,再将单个细胞转化为全长转录本,比微流控的方法的灵敏度更高(单个细胞检测到更多基因数量),但由于单细胞分离步骤的复杂性,测序细胞的通量较低。 基于微流体的平台(例如 10X Chromium)可产生纳升大小的液滴,每个液滴包含一个单元格,以及条形码珠和下游反应所需的试剂。这些平台具有更高的成本效益,因此与孔板系统相比,通量更高。

分析单细胞的另一种方法是质谱流式(CyTOF),它可以通过细胞表达的蛋白质来表征细胞(既可以做细胞表面也可以做胞内)。 在这种方法中,使用结合了金属同位素的抗体对细胞进行染色,然后对其进行四极连杆(TOF)质谱分析。 与传统的基于荧光的流式细胞仪相比,质谱流式的主要优点是不存在光谱重叠,因此所评估标记的数量可能更大(目前多达 50 个标记)。 因此,质谱流式(CyTOF)是现在用于研究健康和疾病中的免疫系统强大的工具。

图 5. 关于肿瘤免疫的分析方法概述,质谱流式(CyTOF)和单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)是唯二的两种单细胞肿瘤免疫的分析实验方法 

        与单细胞 RNA-seq(scRNA-seq)数据相比,质谱流式(CyTOF)数据的可视化方法更加先进,因为许多方法是常规流式细胞仪数据可视化方法的进一步发展。目前,已开发出许多细胞计数数据可视化和聚类工具,例如 viSNE,PhenoGraph,SPADE,X-shift,ACCENSE,FlowSOM 和 Citrus,这些工具已得到全面评估,并总结在表 1 中。可视化单细胞质谱流式(CyTOF)数据的一种有趣方法是支架图,该图基于力导向图,用于揭示不同免疫细胞在不同组织中的分布。通常,为 scRNA-seq 或 CyTOF 数据选择特定的可视化工具取决于功能,语言(例如 R 或 Python),数据集的大小以及计算要求,并且应该在解决问题的背景下进行。

 

工具

描述

显著特性

生信经验

网址

PhenoGraph

CyTOF数据聚类工具

无需手动gating,将质谱流式数据聚类

++

https://github.com/jacoblevine/PhenoGraph

SPADE

CyTOF数据中密度归一化事件的生成树级数

快速可视化,有限定量分析

++

https://github.com/nolanlab/spade

X-shift

CyTOF数据估算的细胞计数加权k近邻密度

优化分层;深入的视觉分析;快速定量分析;

++

https://github.com/nolanlab/vortex

ACCENSE

CyTOF数据的非线性降维和k-均值聚类

t-SNE与基于密度的分区相结合

++

http://www.cellaccense.com

FlowSOM

CyTOF数据的自组织地图聚类和最小生成树

集群;通过星图可视化Marker平均值,或通过饼图可视化细胞类型

++

http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/FlowSOM.html

Citrus

CyTOF高维数据的聚类

统计信息分层; 差异丰度分析; 有限的视觉分析;

++

https://github.com/nolanlab/citrus

表表1. 质谱流式(CyTOF)数据可视化工具汇总

 

恩科生物质谱流式检测服务,为您提供一个从样品到答案的完整解决方案。让您的科研思路脱离维度的限制。

 

 

 

引用内容来自文献:

Nat Rev Genet. 2019 Dec;20(12):724-746.doi: 10.1038/s41576-019-0166-7.


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