马普研究所Jurgen Cox发文公布MBR-ddaPASEF方法，4D对齐全面升级蛋白组学分析
近年来，蛋白质组在生命科学基础研究和临床转化方面的发展日新月异，这一切都有赖于技术上的不断发展。传统的shotgun蛋白质组技术，存在着样品复杂度高而仪器采集分析能力不足的困境，而带来了定量随机性大、精确度不高的问题。虽然人们陆续开发了体外标签定量的TMT技术、数据非依赖采集的DIA方法等，但仍然不能从根本上改变硬件条件所带来的限制。而将离子淌度的分离和检测装置引入蛋白质谱中，催生了全新的“4D蛋白质组学”技术，有望从根本上全面提升蛋白质组学技术的检测能力。
完整的“4D蛋白质组”技术包含硬件设备和软件方法两部分的结合。2018年12月，国际蛋白质组学权威专家Matthias Mann教授在MCP发文，首次正式报道了引入离子淌度的PASEF方法所带来的的蛋白鉴定能力的显著提升（查看详细解读）[1]。而在2019年中的ASMS大会上，德国的Jurgen Cox教授以及Matthias Mann、Reudi Aebersold、Benn Collins和Hannes Rost分别发布了基于离子淌度的MBR-ddaPSEF和diaPASEF的定量方法（查看报道）。
在世界最顶尖科学家的合力推动下，“4D蛋白质组技术”已经从概念进入到了实用阶段，而且仍在继续快速发展。最近，MCP正式发表了Jurgen Cox教授所领衔开发的MaxQuant软件对4D蛋白质定量技术的全面升级，即MBR-ddaPASEF的方法。
研究速读
1. 4D数据能够提高MBR功能的特异性
MaxQuant作为当前蛋白质组领域最常使用的软件，凭借其功能的强大性、可靠性以及可免费使用的便捷性而受到了广大研究者的认可。在定量方面，其所采用的MBR（Match between runs）方法能够有效的提高定量比率。而在全新的版本中，其对于4D数据的全面支持，利用新增的离子淌度维度CCS数值，能够更加有效地提高强化MBR的功能，很大程度上解决传统shotgun proteomics中的missing value和定量平行性的问题。
所谓MBR功能的原理，在于认为一些肽段虽然在当前run中没有二级碎裂检测到，但是其相似的信号在其他run中被检测到了，就认为这个肽段在当前run中也是存在的，并将其一级信号用于定量。这个环节中，何谓之“相似的信号”则变得至关重要。传统的MBR中，主要依据是质谱特征和色谱特征进行匹配，但仍然存在一定的错误概率。而在4D条件下，由于离子淌度CCS数值的引入，可以新增一个对齐的物理量，显著提高MBR匹配的特异性，进一步强化该功能并减少定量的missing value（图1）。
图1. Ion mobility能够提高Match between runs的特异性
2. 4D条件下的MBR功能能够显著提高蛋白质组检测的覆盖度
MBR由于能够在不同runs之间相互匹配，其不但能减少missing value，而且随着runs越多，其鉴定深度也有一定的增加（这是由于有一些肽段能够通过新的runs匹配而得到鉴定）。如下图2a所示，对于细胞样品来说，开启4D-MBR功能后， 平均样品的检测深度从5358提高到5739。对于有效定量来说，通常更加关注在所有样品中共同定量的蛋白，在这个维度上，4D-MBR可以提升大约20%的幅度，从约4500提升到5500的水平。
而在血液这类蛋白丰度动态范围极大的样品中，带来的的提升会更加明显。如图2b所示，使用11分钟短梯度高通量的血液蛋白质组分析方法，开启4D-MBR后从103个蛋白的平均深度上升到208，提升近100%的幅度。
图2. 4D-MBR能够显著提高鉴定深度和定量比率
3. 4D-MBR具有可靠的定量准确性
既然MBR加持下的4D定量在技术上有这么多优越性，那么其定量准确性如何呢？研究者使用定量准确性常用的测评方法进行了如下的实验：将人类细胞、酵母和大肠杆菌的蛋白分别按照1:1、2:1、1:4的比例混合，并进行质谱分析。结果显示，开启4D-MBR功能后，定量蛋白的数目从5819提升到6626，而仍然具有良好的定量准确性，能够真实反映蛋白的混合比例（图3）。
图3. 蛋白混合定量实验显示4D-MBR具备准确的蛋白组定量能力
综上所述，离子淌度和CCS数值的引入，使得蛋白质组进入到了4D的新时代。除了硬件上的革新，配套的软件方法也是4D蛋白质组的重要组成部分，能够在检测深度、定量准确性上获得全面的提升。本篇文章主要介绍在DDA数据采集模式下的MBR-ddaPASEF定量方法。此外，在DIA数据采集模式下，4D平台也能获得全面的性能提升，我们会在后续跟进报道相关进展。
参考文献：
1. Meier F, et al., 2018, Online parallel accumulation – serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics.
2. Nikita Prianichnikov, et al., 2020, MaxQuant software for ion mobility enhanced shotgun proteomics. Molecular & Cellular Proteomics, 2020.
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