Science Advances | 高深度巴豆酰化组学分析揭示其在DNA损伤修复中的重要作用

近年来，蛋白质翻译后修饰的研究走上了快车道，各类突破性成果不断涌现。而在这个车道上，巴豆酰化修饰可谓是一匹“黑马”。2011年，芝加哥大学赵英明教授课题组在Cell杂志上首次报道了巴豆酰化修饰的发现。由于其重要意义，该项工作更是被评为Cell的“年度五大突破性进展”之一[1]。随后的研究中，其在生殖发育、肿瘤发生、转录调控、抗逆胁迫等各方面的作用被相继揭示出来。

国内的科学家在这一领域也是颇有建树，例如在2017年，北大医学部的尚永丰院士和梁静研究员同景杰生物合作，在Molecular Cell上报道了染色质结合蛋白CDYL具有巴豆酰化水合酶的活性。由于其可结合在染色质上，导致局部的巴豆酰辅酶A浓度降低，进而降低结合区域附近的组蛋白巴豆酰化修饰，最终调节精子的发生过程[2]。然而过去的研究往往聚焦在组蛋白上的巴豆酰化修饰，而非组蛋白上的巴豆酰化修饰，尽管也有一些描述性的报道[3-4]，但仍然缺乏广泛的分析和功能机制上的深入研究。

2020年3月13日，北大医学部梁静研究员和景杰生物CEO程仲毅博士合作在国际著名期刊Science Advances发表题为Global crotonylome reveals CDYL-regulated RPA1 crotonylation in homologous recombination-mediated DNA repair的文章，揭示了迄今为止最大规模的巴豆酰化组学分析（14,311个位点），后继功能研究进一步证明了巴豆酰化修饰与DNA损伤修复密切相关。该文章也是2017年Molecular Cell文章的延续工作，北大医学部梁静研究员和景杰生物CEO程仲毅博士为共同通讯作者，北大医学部博士研究生于华婧和景杰生物的卜晨博士为共同第一作者。此外，尚永丰院士也参与了此项工作[5]。

为了探究CDYL下游调控的巴豆酰化修饰位点，研究人员使用SILAC的标记定量蛋白质技术分析比较了CDYL Knockout和WT的HeLa细胞系（样本策略）中巴豆酰化修饰谱。为提高检测深度，使用HPLC将细胞总蛋白分为了10个组分，并分别进行巴豆酰化修饰性多肽的富集；由于CDYL是定位在细胞核中的，为了提高细胞核蛋白的检测深度，研究人员还特地分离了细胞核组分并进行了两次重复检测（质谱策略，图1）。所有的结果合并以后，一共检测到了3,734个蛋白上的14,311个巴豆酰化修饰位点。相比于之前的报道，这是迄今为止肿瘤细胞中最高检测深度的巴豆酰化修饰分析，为进一步挖掘下游信息奠定了坚实的基础。

图1 高深度巴豆酰化修饰组分析的技术路线图

经过生物信息学分析发现，这些巴豆酰化修饰的蛋白，广泛参与了RNA剪接、蛋白质合成降解、DNA复制和修复、内吞作用、细胞间连接等多种生物学过程。在CDYL被knockout之后，DNA复制和修复、RNA剪接过程相关蛋白的巴豆酰化修饰出现了较为显著的上调。根据之前的研究结果，CDYL可以通过降低巴豆酰CoA浓度的方式来负调控其他蛋白的巴豆酰化修饰，但这种调控是局部性的，仅对CDYL直接相互作用或紧靠附近区域的蛋白起作用[2]。已知CDYL主要定位于细胞核的染色质上，因此研究人员特别针对染色质相关蛋白做了网络分析，结果显示许多该类蛋白质的巴豆酰化修饰的确在CDYL被Knockout之后出现了上调。其中，DNA代谢过程的关键蛋白RPA1位于该分析网络图的枢纽位置（图2）。

图2 CDYL Knockout情况下许多染色质结合蛋白的巴豆酰化修饰出现上调

组学定量结果显示，RPA1上的K88，K397和K595三个位点的巴豆酰化修饰在CDYL Knockout条件下出现上调。接下来，通过Co-IP和WB的方法证明了的确RPA1的巴豆酰化修饰水平和CDYL有关。利用景杰生物开发的RPA1巴豆酰化修饰的三个位点特异性抗体，进一步验证了这个变化趋势（图3）。

图3 RPA1的巴豆酰化修饰受CDYL的负调控a，RPA1 K379位点的质谱定量图；b，RPA1整体巴豆酰化修饰水平随CDYL的变化；c，RPA1各个位点巴豆酰化修饰水平随CDYL的变化

已知RPA1在DNA的损伤修复中有重要的作用。为了探究其巴豆酰化修饰是否参与了这个功能，研究人员检测了各种诱导DNA损伤条件下，这三个位点的巴豆酰化修饰水平，发现都有不同程度的上调，这提示其可能的确参与了RPA1介导的DNA损伤修复。为了进一步探寻机制，研究人员通过一系列的生化和细胞学实验，发现RPA1的巴豆酰化修饰并不影响其被招募到DNA损伤位点，但是能够影响RPA1和单链DNA以及其他HR factors（同源重组因子）如resection machinery、RAD51的结合（图4），进而影响功能。

图4. RPA1的位点巴豆酰化修饰对于其和其他同源重组蛋白的相互作用是必要的a，巴豆酰化修饰位点负突变后与其他蛋白的Co-IP实验；b，巴豆酰化修饰位点负突变后与RAD51的免疫荧光共定位

既然RPA1的巴豆酰化对其DNA损伤修复功能很重要，那么这种重要性是否影响到最终的表型呢？通过克隆形成实验发现，RPA1的knockout能够克隆的形成，尽管在非损伤条件下回补WT和突变的RPA1都能够有效恢复克隆数目，但在DNA损伤的条件下只有WT而非突变的RPA1具有回补效果（图5）。此外，过表达CDYL能够造成类似于RPA1突变体的表型。这都证明了，RPA1这三个位点的突变对于DNA损伤条件下的细胞生存非常重要。而后续的流式细胞实验也得到了类似的结论。

图5 RPA1的巴豆酰化修饰对DNA损伤情况下的细胞生存很重要

综上所述，巴豆酰化自被发现以来受到了越来越多研究者的关注，从空间结构到上下游调控再到生理功能，都有愈来愈多的报道。本项工作在之前CDYL调控组蛋白巴豆酰化水平及功能的基础上，通过高深度的蛋白质修饰组学分析，结合具体的生化细胞实验，证明了CDYL对非组蛋白RPA1巴豆酰化修饰的调控和生理意义。这既是目前为止最深覆盖的巴豆酰化修饰组学分析，也是第一次对非组蛋白巴豆酰化进行深入的功能研究。这也表明蛋白质组学技术和生物学实验相结合，是蛋白质修饰研究的有力武器。

巴豆酰化修饰作为最近炙手可热的翻译后修饰研究类型，广泛应用在生命科学与医学研究中。本次，我们邀请到文章并列通讯作者，景杰生物CEO程仲毅博士带来《巴豆酰化修饰与表观遗传、肿瘤代谢和DNA损伤修复》的学术分享。

通过此次分享，您将了解到：

1、巴豆酰化修饰的发现与最新研究进展；

2、巴豆酰化修饰在表观遗传、肿瘤代谢和DNA损伤修复领域的应用。

时间：2020年3月17日15:00-16:00

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