中科院水生所葛峰组揭示丙酰化修饰新功能：参与光合作用和碳代谢调控
翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指蛋白质在翻译后的化学修饰，越来越多的研究发现，许多重要的生命活动不仅与蛋白质的丰度相关，更重要的是被各类PTM所调控。随着表观遗传学与生物学领域的深入研究，一系列新的酰化类型，如丙酰化、丁酰化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化、二羟基异丁酰化、三羟基丁酰化、苯甲酰化、乳酸化等被陆续发现，广泛地存在生物体内，与炎症、代谢疾病、肿瘤等疾病密切相关，极大的扩展了人们对代谢调控、信号转导等生命活动的认识。
赖氨酸丙酰化（Lysine Propionylation，Kpr）是一种可逆的、广泛分布的翻译后修饰类型，在真核生物和原核生物中均起重要的调控作用。已有研究报道赖氨酸丙酰化在细菌的整体代谢调控网络和代谢酶的活性中起重要作用【1】，并且可能与精子生成与精子功能的发挥密切相关【2】，然而，赖氨酸丙酰化在光合有机体中的程度和功能尚不清楚。
近日，中国科学院水生生物研究所的葛峰研究团队在国际专业学术期刊International Journal of Molecular Sciences上发表了丙酰化修饰最新研究成果。研究首次对丙酰化在光合作用生物——蓝藻中的调控功能展开研究，揭示了丙酰化修饰新的生物学功能：参与光合作用和新陈代谢调控，为丙酰化调控的功能范围提供了新的见解。
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鉴定Synechocystis中赖氨酸丙酰化蛋白
蓝藻（Cyanobacteria )是最古老的革兰氏阴性细菌群体，具有很强的产氧光合作用能力。为了评估蛋白质丙酰化在光合作用生物中的可能作用，研究人员以集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803（一种单细胞蓝藻）作为模型，对赖氨酸丙酰化功能进行了系统性地研究。
研究人员首先以Synechocystis 裂解产物为实验对象，通过WB实验观测不同胁迫条件下丙酰化修饰信号变化，结果表明赖氨酸丙酰化是一种广泛存在的蛋白修饰，可能参与了Synechocystis的应激反应。接着，通过结合高特异性丙酰化泛抗体（景杰生物，PTM-201）与高深度LC-MS/MS的蛋白质组学手段研究Synechocystis体内的丙酰化，共鉴定到位于68个蛋白上111个丙酰化修饰位点。
图1. WB预实验与组学实验流程
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生物信息学分析
GO富集分析结果显示丙酰化蛋白最显著富集在光合作用这一生物进程和翻译伸长因子活性，翻译因子活性与核酸结合，氢离子转运ATP酶活性和旋转机制这些分子功能上。光合作用和蛋白质翻译活动是相互作用、相互协作的，而赖氨酸丙酰化可能是蓝藻中协调这两个过程的机制之一。针对丙酰化修饰位点，研究人员进行了motif分析、二级结构预测分析；此外，针对鉴定到的所有蛋白通过蛋白互作分析评估蛋白在物理和功能方面的相互作用。网络共由331个蛋白组成，其中存在17个参与丙酰化光合作用的丙酰化蛋白，如别藻蓝蛋白（slr0335, ApcE; slr1986, ApcB;slr2067, ApcA; sll0928, ApcD）、藻青蛋白（sll1578, CpcA; sll1577, CpcB）、ATP合成酶（sll1324, AtpF; slr1329, AtpB; sll1326, AtpA）、电子传递/卡尔文循环（slr0009, RbcL; slr1643, PetH; slr0364, Pgk）、光合系统Ⅰ（slr1835, PsaB; sll0819, PsaF; slr0737, PsaD）和光合系统Ⅱ（sll0427, PsbO; sll0851, PsbC）。通过生物信息分析预测和发掘丙酰化的作用，这将有助于从这些蛋白中选择关键蛋白和探索可能的机制。
图2. 生物信息学分析
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丙酰化影响代谢酶活性
为了确定丙酰化蛋白参与的分子通路，研究人员对所有鉴定到的蛋白进行了KEGG通路分析，结果发现很多参与代谢通路的酶都具有丙酰化修饰，比如参与碳固定和糖酵解通路的酶，这一结果与之前的研究报道是相一致的。此外，在实验结果中有鉴定到两个可靠的修饰位点（Lys156和Lys336）位于研究人员关注的蛋白FbpⅠ上，FbpⅠ是Synechocystis中唯一被识别的将果糖-1,6-二磷酸转化为果糖-6-二磷酸的酶，这一过程与卡尔文循环、氧化光磷酸循环和产氧光合生物中的糖异生有关。接着，研究人员通过将位点突变为R来验证Lys156和Lys336是否会影响FbpⅠ的活性，结果显示在突变体中酶活下降，表明丙酰化可以改变FbpⅠ活性以及赖氨酸丙酰化参与细胞代谢的调节。
图3. Synechocystis碳代谢过程中丙酰化修饰活动
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验证参与光合作用的丙酰化蛋白
研究人员从质谱结果中挑选了4个光合作用的蛋白（PsaD，PsbC，CpcB和PsbO）进行免疫沉淀和WB验证，结果显示PsaD在缺氮、HL（Hight Light）和葡萄糖条件下丙酰化水平呈上调；PsbC丙酰化水平在HL条件下显著升高；CpcB丙酰化水平在HL和葡萄糖条件下显著上调；PsbO丙酰化水平在缺氮和葡萄糖条件下受到明显影响。因此丙酰化状态的改变表明丙酰化可能在不同环境应激中具有重要的调控作用。
图4. 4个丙酰化蛋白的疫沉淀与WB验证
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高光条件下PsaD丙酰化水平升高
基于免疫沉淀与WB的结果，研究人员进一步验证对PsaD蛋白在不同光强度条件下的丙酰化状态进行验证，WB结果显示PsaD丙酰化水平在不同时间HL条件下表现出升高的趋势。接着，为探究HL对丙酰化影响的更多细节，研究人员针对鉴定到的PsaD蛋白的Lys132开发了位点特异性抗体（PsaD在植物中具有高度保守性），实验结果显示在长时间的HL暴露下Lys132位点的丙酰化水平显著升高，这表明Lys132丙酰化可能是一种新的应激HL胁迫的机制，而且并不体现在其他条件胁迫中。综上研究表明，Lys132可能在调控光合作用过程中起重要作用。
图5. Lys132特异性位点抗体验证丙酰化水平改变
综上所述，研究人员通过采用质谱检测的方法在Synechocystis中鉴定到位于68个蛋白上111个丙酰化修饰位点，进一步生物信息分析表明丙酰化蛋白中有很大部分蛋白参与光合作用和新陈代谢。通过定点突变和WB验证，研究了赖氨酸丙酰化对果糖-1,6-双磷酸酶(FbpI)酶活性的作用意义。进一步的功能研究发现光系统I (PsaD)亚基II在HL处理后明显升高，这表明丙酰化可能参与了Synechocystis对强光的应激过程。
总之，研究结果首次证实了丙酰化修饰参与光合作用和新陈代谢调控，为丙酰化调控的功能范围提供了新的见解，同时揭示了可逆的丙酰化是一种功能性修饰，在Synechocystis中具有调控光合作用和碳代谢的潜力，这种潜力同样存在其他光合作用有机体中。
参考文献
1. JunYu Xu, et al. (2018), Protein Acylation is a General Regulatory Mechanism in Biosynthetic Pathway of Acyl-CoA-Derived Natural Products. Cell Chemical Biology.
2. ZiQi Shen, et al. (2018), Characterization of the Sperm Proteome and Reproductive Outcomes with in Vitro Fertilization after a Reduction in Male Ejaculatory Abstinence Period. Molecular & Cellular Proteomics.
3. Mingkun Yang, et al., (2019), Lysine Propionylation is a Widespread Post-Translational Modification Involved in Regulation of Photosynthesis and Metabolism in Cyanobacteria. International Journal of Molecular Sciences.
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