水稻通过调控乙酰化和琥珀酰化修饰响应非生物氧化胁迫

盐碱、干旱、极端温度等非生物胁迫是严重影响植物生长和发育造成农作物减产的主要原因，所有这些胁迫都会引发细胞内活性氧的大量积累，从而给植物带来氧化胁迫。近日，由南京农业大学谢彦杰组和合作者在植物领域著名期刊《Plant Cell & Environment》上发表文章，首次报道水稻通过改变自身乙酰化和琥珀酰化修饰来响应外界氧化胁迫刺激。本研究在水稻叶片中一共鉴定到2593个琥珀酰化蛋白(5502个位点)和1024 乙酰化蛋白（1669个位点），其中有 723个蛋白同时发生乙酰化和琥珀酰化修饰。并且通过组学线索寻找到在胁迫条件下，和氧化胁迫密切有关的过氧化氢酶CATA和谷胱甘肽转移酶OsGSTU6上的修饰也发生了显著变化（非组蛋白修饰研究），并通过去琥珀酰化修饰体外实验验证了去琥珀酰化修饰，会显著影响过氧化氢酶CATA和谷胱甘肽转移酶OsGSTU6的活性。

本文进一步扩宽了特别是在植物里面乙酰化和琥珀酰化修饰蛋白的种类，同时为后续进一步做深入的植物逆境胁迫分子机制研究提供非常多的线索，并建立了扎实的组学数据基础；同时，也给我们提供了一条非常好的修饰组学+验证的文章写作思路和策略。为其他如拟南芥、大豆、小麦等植物研究领域后续开展修饰组学提供了借鉴和参考。

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关键词：

乙酰化、琥珀酰化、水稻、氧化胁迫、CATA、OsGSTU6

研究思路与结果

首先，研究者选取氧化胁迫前后的水稻叶片进行高通量蛋白质组学和乙酰化/琥珀酰化修饰组学分析。通过质谱分析，一共鉴定到2593个琥珀酰化蛋白(5502个位点)和1024 乙酰化蛋白（1669个位点），其中有 723个蛋白同时发生乙酰化和琥珀酰化修饰；这也创造了目前已报道的植物领域乙酰化谱和琥珀酰化谱通量的新的世界纪录。（见表一）

表1. 本研究中鉴定到的乙酰化/琥珀酰化通量 vs 此前其他研究

研究人员进一步对鉴定到的琥珀酰化的蛋白进行KEGG富集分析和亚细胞定位分析，发现在碳代谢途径和叶绿体亚细胞结构里面富集最显著；同时对鉴定到的琥珀酰化的domain分析和motif分析，发现最容易发生琥珀酰化的domian主要有Thioredoxin-like等，容易发生琥珀酰化的motif 主要为R-9Ksu、K-10Ksu等（如图一，图二左边）；同样对鉴定的乙酰化肽段进行上述KEGG富集、domain 分析和motif分析，发现乙酰化肽段主要在histone相关domain富集最明显， motif分析显示主要在Kac R+1、Kac K+1等较为显著。（图二右边）

图1.  A. 组学实验前使用WB筛选合适时间点样品，

B. 开展乙酰化/琥珀酰化组学质谱分析流程；

C. 亚细胞分析琥珀酰化蛋白分布；

D. KEGG富集分析琥珀酰化蛋白富集分布。

图2. 左边：琥珀酰化肽段domain分析（A）和motif分析（B和C） 

右边：乙酰化肽段KEGG分析（A）, domain分析（C），motif分析（B和C）

在上述基础上，研究人员进一步对鉴定到的乙酰化蛋白和琥珀酰化蛋白开展Venn分析和通路分析，特别是对723个同时发生上述两种修饰（Kac&Ksu）的蛋白分析，他们发现这些蛋白主要集中在糖酵解、TCA循环和戊糖磷酸途径中。

图3. 发生Kac和Ksu的蛋白在重要代谢途径里面的分布

接下来，作者发现在氧化胁迫前后，对差异上下调明显的琥珀酰化和乙酰化蛋白进行KEGG富集分析，发现琥珀酰化蛋白主要在核糖体途径，乙醛酸及二羧酸代谢途径显著上调，同样在乙醛酸及二羧酸代谢途径、内质网蛋白加工和光合碳固定途径显著上调；而乙酰化蛋白主要在乙醛酸及二羧酸代谢途径、谷胱甘肽代谢、丙氨酸&天冬氨酸/谷氨酸代谢以及半胱氨酸/甲硫氨酸代谢。最后对氧化胁迫前后，同时发生两种修饰显著富。

图4. 氧化胁迫前后Kac/Ksu差异蛋白KEGG通路富集分析

为使得研究工作更进一步，作者首次在植物里面聚焦非组蛋白酰化修饰对蛋白功能和活性影响；代表性的挑选和氧化胁迫密切相关的两个酶：过氧化氢酶CATA和谷胱甘肽S转移酶OsGSTU6，进行体外去琥珀酰化实验，在体外体系中加入去琥珀酰化酶Sirt5，Western blotting结果显示， CATA和OsGSTU6琥珀酰化修饰水平均有下降，但是CATA的酶活性显著增强，而OsGSTU6酶活显著减弱，说明琥珀酰化对两个酶具有相反的酶活调控机制。

图5. CATA和OsGSTU6琥珀酰化修饰对自身酶活的影响

总结：

本文主要是将水稻这一重要的经济作物作为研究材料，首次从乙酰化和琥珀酰化全组学的角度，揭示了水稻在氧化胁迫的情况下，两种修饰的差异变化，以及对其中重要通路途径的调控进行分析，为后续深入研究分子机制奠定了组学基础。

1、目前已报道的植物领域乙酰化谱和琥珀酰化谱通量的新的世界纪录！

2、首篇在植物逆境胁迫研究方向的乙酰化/琥珀酰化双修饰组学文章;

3、首次聚焦和研究植物非组蛋白酰化修饰的变化对蛋白功能和活性的影响;

资深的研究人员应该也很容易看出，这篇文章其实只是初试牛刀，通过组学筛选到一系列的和胁迫相关的乙酰化修饰和琥珀酰化修饰蛋白，作者只是挑选了其中两个蛋白，初步研究修饰对酶活的影响。那么其他也有显著差异变化的酶和蛋白是不是也有类似的机制仍有待于作者进一步铺开深入研究。而对于具体修饰如何引起酶活变化，哪个核心结构域的修饰会影响酶活，仍需后面进行深入研究，特别是体内/模式植物的实验进行研究。这里面肯定还隐藏着大量的非常有意思的科学故事，当然每个故事讲的好，都可以发表一篇不错的文章。

因此，这篇文章只是相当于宝藏之隅，还有很多金子等待研究者去淘！这也从侧面证明，对那些陷入山重水复疑无路的课题而言，柳暗花明又一村并不遥远，您需要的是一个好的科学实验设计和好的组学结果。

参考文献

1. Zhou H, et al. Oxidative stress-triggered interactions between the succinyl- and acetyl-proteomes of rice leaves. Plant Cell Environ. 2017