蛋白质修饰类抗体FAQ-WB实验

1、Western Blot的泛抗体实验中，为什么总是出现只有一条带的情况?

答：(1) 首先要确定这条带的大小；比如，组蛋白H3的信号会很强，经常出现在17kD左右，如果曝光时间短的话，很可能只存在信号强的条带；

       (2) 上样量是否足够；

       (3) 抗体浓度是否正确使用；

       (4) 荧光底物不灵敏，可调整荧光底物的孵育时间、曝光时间等。

2、Western Blot实验中是否条带越多，蛋白修饰的丰度越高?

答：(1) 客户提到的修饰丰度指什么，是一种蛋白的修饰强弱，还是指修饰的广谱性?

       (2) 同一样品，不同处理的对比，可以这么说；

       (3) 不同样品，不同来源，无可比性；

       (4) 条带的强度，可以体现该条带大小的蛋白修饰丰度高。

3、我们的泛抗体做Western Blot的比例多少，100微升可以做多少次?

答：我们推荐稀释比例都是1:1000，客户可以根据实际情况自行调整。

4、用乙酰化、琥珀酰化泛抗体做Western Blot检测，客户做不出条带的原因?

答：我们的乙酰化、琥珀酰化泛抗体在生产之后都有专门的质量检测，且在所有抗体销售中是销量较好、客户评价最高的两类的抗体，质量是毋庸置疑的。建议帮助客户从自身Western Blot检测的实验中找原因。

5、Western Blot显示条带丰度较好，质谱鉴定到的蛋白种类比条带丰度相对不好的蛋白种类要少?

答：Western Blot某一个条带不代表一种蛋白，而是相同分子量的一类蛋白群。因此一个丰度较好的条带里很可能既存在实际丰度高的蛋白，也存在丰度极低的蛋白，而这些丰度极低的蛋白在质谱中鉴定不到是很正常的。

6、Western Blot没有看出明显变化，为什么还需要做修饰定量分析?

答：(1) Western Blot的信号分辨率和灵敏度不如质谱，蛋白质谱可以对复杂样品进行分离和鉴定，得到大规模的数据，挖掘细微的修饰水平变化。

             (2) Western Blot的某信号条带显示的是分子量相近的一群蛋白的综合信号强度。如果在样品处理前后，该位置的有些蛋白发生修饰上调而有些下调，又或者有些蛋白去除修饰而有些蛋白发生修饰，这样的变化都是没法反应在Western Blot信号上的。

7、修饰性Western Blot中经常出现低质量处没有条带的原因?

答：(1) 进行SDS-PAGE，看低质量处的蛋白条带丰度如何，确保蛋白的量是足够的；

       (2) 胶的压缩分离效果不好，低质量蛋白本身易弥散，且泳动速度快，易跑出分离胶。

8、Western Blot某蛋白有条带，但是MS没检测到该蛋白。为什么?

答：(1) Western Blot是在蛋白水平的检测，MS是基于肽段水平的检测；一般来说免疫水平的检测灵敏度是高于质谱检测的；

       (2) Western Blot某条带为分子量相近的一类蛋白，包含蛋白的丰度不同，有高有低；而质谱一般检测不到过低丰度蛋白；

             (3) 该蛋白氨基酸序列中K或R过多或过少，导致胰酶切割形成的肽段太短或太长，不易被质谱捕获;

             (4) 样品复杂，和该蛋白酶解肽段具有相近质荷比的肽段太多，该蛋白的肽段不易被质谱检测到；

             (5) 质谱检测还与该蛋白酶解后肽段的氨基酸组成有关;

             (6) 蛋白质组数据库不全，没有该蛋白序列，导致质谱鉴定后搜库检索不到.

9、为什么组蛋白位点特异性抗体的Western Blot中会出现杂带?

答：通常情况下，组蛋白位点特异性抗体只会出现一个特定的阳性条带；但在极少数情况下，位点特异性抗体所识别的构象与较大分子量的部分序列不可避免的相近时，会出现杂带，但并不会影响检测的结果。同时，合理提高抗体的稀释比可以让杂带消失，也可以尝试降低曝光时间或将上样量进行调整。

10、关于磷酸化蛋白Western Blot的建议?

       答：(1) 激酶信号通路复杂而敏感，实验取材和裂解要迅速，比如贴壁细胞不要用胰酶消化，直接加入裂解液刮细胞。

             (2)一定要在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解和去磷酸化。不加抑制剂的话，即使检测到磷酸化条带也会很浅，结果不可靠；

             (3) 转膜时间和温度，一抗和二抗的稀释倍数，封闭液的浓度，洗涤液中Tween-20的浓度，洗涤的次数和时长，显影或成像的参数，这些参数要进行优化；

             (4) 磷酸化的蛋白只占总蛋白量的极少部分，一抗孵育时最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间;

             (5) 磷酸化蛋白的Western Blot要使用BSA封闭。不能使用牛奶做封闭液，因为牛奶酪蛋白磷酸化程度高，会干扰检测

             (6) 要检测该样品中总蛋白的表达量；如使用phospho-p38抗体做完修饰后，我们会把相同的膜用stripping buffer再生，然后孵育p38抗体，检测总蛋白水平。

             (7) 有些蛋白磷酸化后电泳泳动速度慢于相应的非修饰蛋白，在Western Blot上呈现出磷酸化条带高于非修饰蛋白条带的现象，这是正常的。

11、Western Blot中孵育一抗前封闭的原理以及封闭液的选择?

答：(1) 在电泳转膜后，膜上其它没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免非特异性结合；封闭就是降低一抗的非特异结合的概率，因为封闭液本身就是蛋白，封闭就相当于把那些太容易发生非特异结合的位点先给堵上了；过度的封闭导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵敏度；不完全封闭又会导致最终背景增高或信噪比太低；

            (2) 封闭液一般用BSA或者脱脂牛奶。很多人的经验是：脱脂牛奶封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会干扰检测）