NGS 应用中的核酸定量

新一代测序（NGS）的应用范围越来越广，特别在无创产前检测（NIPT）领域有着越来越成熟的应用。对于NGS 的文库制备，我们经常需要对起始核酸样品进行质量评估，而制备好的文库我们也要进行准确的浓度检测以进行后续的均一化。

通常核酸浓度测定是首先测定样品在260 nm 下的吸光值，然后用特定的换算因子进行浓度计算。但吸收光法灵敏度较低，并且当样本中存在其他种类核酸污染时，无法进行特异性定量。

图1：吸收光法dsDNA检测，分别进行浓度和纯度（A260/A280）的测定。
         
其实，测定核酸浓度还有一种方法，即通过荧光染料进行间接检测。荧光染料能够特异性地和目的核酸结合，灵敏度也比传统的光吸收法高出1000 到10000 倍。

荧光检测和吸收光检测的比较

常见有Qubit 和PicoGreen 荧光定量试剂盒用于dsDNA 的定量。对于同一样品，分别采用PicoGreen定量试剂盒（配合Eppendorf BioSpectrometer fluorescence 分光光度计和UVette比色皿）和Qubit dsDNA HS 定量试剂盒（配合Life technologies  Qubit 2.0 荧光计和专用0.5 mL  反应管）进行荧光法核酸定量。PicoGreen 的检测结果与Qubit 仅相差10% 左右，两者都能准确地反映样品的实际浓度。

当然，吸收光法也有它的优势。首先，吸收光法可提供A260/A280和A260/A230比率，用来评价核酸样品的纯度。 其次，它的使用成本低，不需要配套试剂盒。并且操作更简便，无需标准曲线，直接进行检测。
        
其实，NGS的实际应用中，既需要Qubit类的荧光计进行准确核酸定量，也需要吸收光分光光度计进行快速纯度检测，而集两种功能于一身的 Eppendorf BioSpectrometer fluorescence荧光款分光光度计是您的理想选择。

另外，在BioSpectrometer fluorescence软件中预设了“PicoGreen short”简短程序，即只有0和500ng/mL两个标准品。该方法的优势是操作简便快速，并节约昂贵的荧光检测试剂。而“PicoGreen short”得到的样品浓度与常规五个标准品进行分析得到的样品浓度非常相近。

   
在BioSpectrometer fluorescence上不同荧光方法的核酸定量，采用Eppendorf Macro Vis Cuvettes比色皿，左图为PicoGreen程序，右图为PicoGreen-short程序。

其实BioSpectrometer fluorescence与Eppendorf Vis Cuvette常量比色皿、Eppendorf UVette微量比色皿或 Eppendorf μCuvette G1.0 超微量比色皿均可以配合使用。

                                           
Eppendorf不同规格比色皿，左图- Vis Cuvette常量比色皿，中图-UVette微量比色皿，  右图- μCuvette G1.0 超微量比色皿

而采用UVette 或μCuvette G1.0可以显著降低测量体积，100 μL或5μL足够进行测量。这样可以节约荧光试剂，配合“PicoGreen short”程序（1个样品对应3个反应，而对于PicoGreen程序1个样品对应6个反应）可大大降低试剂成本。

另外，分别用UVette和μCuvette G1.0在Eppendorf BioSpectrometer fluorescence分光光度计上基于“PicoGreen short”应用程序进行两个样品的荧光法核酸定量。两种比色皿的检测结果相当，重复性好。   

因此，Eppendorf BioSpectrometer fluorescence配合UVette塑料比色皿或 μCuvette G1.0 超微量比色皿，采用“PicoGreen short”预设应用程序，在保证结果准确的前提下，还能减少荧光试剂的消耗。同时该仪器的吸收光功能还能提供核酸纯度的相关信息，从而对NGS文库进行准确而可靠的质量评估。