QIAGEN高通量测序解决方案助力新型冠状病毒研究

作为分子生物学领域的行业领导者，QIAGEN旗下多款经典病毒核酸纯化试剂盒就以其回收率高、核酸纯度高、多样本兼容性的优势在2019-nCoV实验检测环节中 “站好了第一班岗”。同时QIAGEN提供了基于不同技术和方法的检测方案，包括高通量测序技术和生物信息学数据分析方案。

2019年底突如其来的新型冠状病毒，让我们再次认识到了广泛分布且种类繁多的病原微生物对人类的威胁。面对一场突如其来的疫情，既要采用科学的手段快速发现并认识病原微生物，同时也要基于科学的认识制定可行的临床检测和治疗方案。多年来分子生物学的技术及产业化发展，使得荧光RT-PCR在这一过程充分发挥了无可替代的作用。与此同时，新兴的高通量基因测序技术通过直接对病毒基因组进行全面分析，更加灵敏、准确的揭示病毒的“真实面目”，在克服如今因RT-PCR技术限制而引起的“假阴性”问题方面发挥了重要作用。高通量测序结合生物信息分析，对于2019-nCoV的首先确认、动态分析、进化来源以及致病机制、传播途径研究等具备了无可比拟的优势。

除了新型冠状病毒外，近年来造成人类感染的病原微生物也日益复杂，同时抗菌药物滥用与细菌耐药已成为全球关注的焦点。如今，高通量测序已经迅速成为临床实验室的重要检测平台，延展并提高了经典微生物方法的检测能力，本次在线讲座我们将带领大家更好的了解高通量测序和生物信息学数据分析在病原微生物检测中的应用。

讲座内容：
1. 高通量测序在病原微生物检测中的应用
2. 病原微生物基因组生物信息学分析

讲座时间：2020年2月26日，3:30pm-5:00pm
报名方式：扫描下方二维码注册

作为分子生物学领域的行业领导者，QIAGEN旗下多款经典病毒核酸纯化试剂盒（以QIAamp Viral RNA Mini Kit为代表）就以其回收率高、核酸纯度高、多样本兼容性的优势在2019-nCoV实验检测环节中 “站好了第一班岗”。同时QIAGEN提供了基于不同技术和方法的检测方案，包括高通量测序技术和生物信息学数据分析方案，下面就让小编针对检测流程中的技术环节为大家进行解读。

病毒核酸全转录组扩增

实际的检测过程中可能拿到的并非都是最佳样本，如来自上呼吸道的咽拭子就因其自身病毒含量低而极易造成检测假阴性。面对这样的现实困境，我们在提高核酸产量、质量的同时，也可以借助 “全转录组扩增技（WTA）”技术对核酸进行均等的放大，解决样本量不足的难题。

基于QIAGEN充分优化改良的 “多重置换扩增（MDA）”技术，REPLI-g WTA Single Cell能够针对单个细胞或pg级纯化RNA进行快速的全转录组扩增。区别于传统PCR类扩增方法，REPLI-g可在等温条件下进行均等、高保真的高灵敏度扩增，双链cDNA产物非常适用于下游进行高通量测序（二代或三代测序）、PCR等方法检测，也多次被运用于类似疫情的检测方案中，如在2014年西非埃博拉病毒以及2016年中国南方的寨卡病毒疫情方案中，来自中国疾控中心、广东省疾控中心等单位的研究人员就已将REPLI-g应用在对抗疫情的实战中。

人源等宿主rRNA去除

疫情检测所采用的样本绝大多数来自呼吸道、血液等，纯化后的核酸产物中还存在着大量的人源RNA，占用大量数据的同时还会对结果的准确性产生潜在影响。通过对测序的结果进行分析，我们可看到人源rRNA序列占比极高，因此我们可以通过去除人源rRNA等手段来部分解决这一问题。此时，又到了QIAseq FastSelect展现其真正实力的时候了！

借助独特的“黑科技”，QIAseq FastSelect HMR Kit仅需通过简单的1步加样以及一段程序性降温孵育，无需任何纯化步骤，便能在14分钟内完成样品中人源或其他哺乳动物来源rRNA的高效去除。这一过程可与REPLI-g WTA Single Cell Kit以及几乎所有其他的逆转录试剂盒、RNA建库试剂盒相兼容，在避免因多步纯化而造成病毒核酸损失的同时，还可极为快速地完成rRNA去除这一限速步骤。此外，如果在粪便、肛拭子等样本中存在较多的细菌组分，我们也同样可以利用QIAseq FastSelect 5S/16S/23S Kit结合QIAseq FastSelect HMR Kit在一步流程中同时完成全部细菌和宿主rRNA的去除，十分便捷。
 
NGS文库构建

在完成rRNA去除并对RNA进行逆转录反应（含二链合成）后，一款高效的建库试剂盒是完成cDNA样品文库构建的测序前关键步骤。作为相关病原体测序及宏基因组学研究领域的“明星”，QIAseq FX DNA Library Kit采用“单一”核酸酶，以“无序列偏好性”的酶切打断方式将DNA进行随机片段化，不受基因序列影响且可将G/C偏好性降至最低，能够很好的避免因机械打断带来的样品损失而造成潜在病原信息丢失，并实现远远超越其他酶法的基因组覆盖率。

此外，QIAseq FX DNA Library Kit还将DNA片段化并入精简的优化建库方案中，无需在片段化和接头连接反应之间进行纯化，最快1.5小时内便能完成文库构建；结合高效的连接反应，该试剂盒可兼容20 pg- 1000 ng的起始DNA，进一步更加有效的将病原信息进行保留。当与REPLI-g WTA Single Cell Kit配合使用，或cDNA高于100 ng时，还可进行PCR-free建库，避免了因扩增导致的错误或偏倚，确保数据的真实性。QIAseq FX现已可适配于Tecan、Hamilton、epMotion等多种自动化工作站，为提高检测效率也提供了重要的保障。

基因组拼接

全基因组序列的获取是从根本上认识该病毒的基础。在测序技术日新月异的今天，有多种方法可以快速获得一个~30K的病毒基因组序列。主要有基于二代测序的短读长测序方法（Illumina和BGI/MGI等）和基于单分子测序的长度长测序方法（PacBio和Nanopore等）。现阶段，为了保证拼接的准确性和基因组的完整性，通常会结合两种测序方法。然后基于DBG 或OLC算法进行基因组拼接和polish。QIAGEN推出的基于桌面化操作系统的CLC Genomics Workbench 20.0软件，提供了Illumina, PacBio, Nanopore, BGI/MGI等测序数据分析和拼接的全套模块，包括：De novo assembly (short reads); De novo assembly (long-read); Long read correction; Hybrid assembly等方法。

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多重序列比对和进化树构建

获得全基因组序列后，接下来就可以将该序列和已知的病原菌序列进行多重序列比对，构建分子进化图谱。这也是在此次疫情中确定2019-nCoV是一种新型冠状病毒而不是SARS或MERS最直接的证据。对于该功能CLC Genomics Workbench 20.0也提供了一站式工具，包括NCBI病原菌序列下载、本地病原菌序列数据库构建、多重序列比对、进化树构建等。

变异和演化分析

随着病毒在人群中的传播，可能会出现基因组的变异。演化分析可以基于目前获取的所有患者2019-nCoV病毒的序列进行比对，挖掘低频突变，从而结合患者的临床表型和治疗方法进行实时追踪。CLC Genomics Workbench 20.0中经典的mapping、variant calling、create SNP tree和Maximum Likelihood Phylogeny Tree等模块可以轻松完成变异和演化分析。

耐药性分析

毫无疑问每个人都在期盼一款能够靶向2019-nCoV病毒的药物，然而一种药物的研发和临床验证通常需要比较长的周期。此外，对于靶向药物，同样需要关注基因组的快速突变带来的耐药性问题。针对这一挑战，CLC Genomics Workbench 20.0 同样也提供了耐药性分析相关的数据库和工具，包括：

• ARESdb database: 来自全球200个中心，11,000个耐药性菌株
• ResFinder database: 包含3,096个耐药性相关的基因
• PointFinder database: 包含4,552个耐药性相关的变异位点
• ARG-ANNOT: 包含1,723条耐药性相关的的蛋白标签序列

过去几周来自中国疾控等单位的科学家在其研究中也分别采用了QIAGEN样本制备（QIAamp Viral RNA Mini Kit）和数据分析（CLC Genomics Workbench ）等解决方案进行了冠状病毒的测序和基因组分析并相继发表在NEJM[1]和The Lancet[2]国际顶尖杂志。2020年2月26日由QIAGEN举办“病原微生物基因组测序和生物信息学分析”专题网络研讨会，将为广大一线工作人员带来病原微生物检测技术交流和优秀解决方案推荐。

参考文献
1. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. NEJM, DOI: 10.1056/NEJMoa2001017
2. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. The Lancet, DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-