【新手快速入门】miRNA的qPCR检测

测序技术的引入促使miRNA研究领域进入快速发展阶段，然而qPCR仍是验证测序数据的重要标准。本文将为您介绍使用qPCR进行miRNA分析的基本要点，希望能帮助新人快速入门。

什么是miRNA？

miRNA是一类小的非编码RNA，能够与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，通过作用于mRNA，进而介导转录后基因表达。通常情况下，miRNA-RICS复合物能够通过阻断靶标miRNA的翻译或促使其降解，从而起到抑制mRNA表达的作用。多数miRNA长度约为18‒22个核苷酸，在样本中的总RNA量中仅占很小的一部分。通常认为总RNA中miRNA的量大约为0.01%(1)。

经过多年研究，一些mRNA与其相应miRNA之间的调控作用已经取得了较多的数据积累。miRNA参与的生物过程包括分化、发育、信号转导和宿主感染应答。此外，多项研究结果表明，miRNA表达失调是癌症等疾病的病因，或是某些疾病的指标。循环miRNA表达与疾病有关，并且血清和血浆中能作为检测样本来源，因此循环miRNA极有潜力成为疾病相关生物标志物。

目前的miRNA检测技术

探究miRNA在细胞水平的功能和转录后的调控机制，必须采用适宜的检测方法。目前常用的方法包括定量real-time PCR、深度测序和微芯片。每种方法都有其各自的优缺点，下文会为您详细说明。

定量逆转录PCR（RT-qPCR）

在《Annual Review of Analytical Chemistry》的一篇文章中提到，“如果选择一种方法作为miRNA检测的金标准，则非RT-qPCR莫属。(1)”之所以这样说，是因为qPCR的多项特性都满足miRNA检测的关键要求：该方法准确且经济，无需大量的样本，并且检测范围灵活。使用qPCR检测RNA时，需要留意若干重要因素，包括RNA的纯度与质控、cDNA合成、引物设计、检测和数据均一化。检测血液中的miRNA时，数据均一化较为挑战，需要特别考量以进行有效的均一化化并获得有意义的数据结果。

1 第一步：cDNA合成

RT-qPCR的第一步是将样本中提取的RNA逆转录为cDNA。这一步通常面临的问题包括：(1)模板仅有大约22个核苷酸，(2)成熟体miRNA、前体miRNA和初级转录物并存。

目前逆转录miRNA主要有两种方法：

-使用不同miRNA的特异性引物进行逆转录

-使用样本中所有miRNA的通用引物进行逆转录

每种方法都有各自的优势和缺点。miRNA特异性逆转录引物能够有效降低背景噪音，而通用引物则适合于同时研究多种不同miRNA的情况。通用引物通常需要加入poly(A)尾巴和oligo-dT引物，为后续所有miRNA的cDNA同时合成提供基础。QIAGEN的miScript II RT Kit能够进行简便的一步法cDNA合成，实现对样本中所有miRNA的检测。该试剂盒含有两种缓冲液miScript HiSpec Buffer和miScript HiFlex Buffer，能够特异性的只逆转录成熟体miRNA或将全部RNA转化为cDNA，以满足不同的研究需求。

2 第二步：miRNA特异性引物设计

cDNA合成后，即可开始qPCR。在qPCR中需要使用合适的引物。目前常用的两种miRNA qPCR荧光染料为SYBR Green和双标记水解探针。

SYBR Green为嵌入型染料，结合在DNA的碱基之间。结合到dsDNA上之后，荧光强度增强约100倍，实现PCR过程中对扩增产物的检测。SYBR Green方法的显著优势是无需为不同miRNA设计特异性探针。然而由于SYBR Green法会检测到非特异性PCR产物和引物二聚体，需要通过熔点或熔解曲线分析验证反应特异性。在温度从65⁰C到95⁰C的逐渐升温过程中，记录荧光强度，当DNA链开始解离时，荧光强度降低(2)。如果熔解曲线只有一个峰，则表示反应中未生成非特异性扩增产物。

与SYBR Green法不同，双标记水解探针不会检测非特异性PCR产物，但使用序列特异性探针时PCR特异性仍然不容忽视——人工产物会致使真正的PCR产物产量降低。特异性产物和人工产物对于反应成分的竞争，可能会影响分析灵敏度和效率。

3 第三步：内参RNA的选择与数据均一化

为通过real-time PCR达到准确、可重复的miRNA定量结果，需要采用合适的内源性参比miRNA对被测miRNA的量进行均一化。这一方法被称为相对定量。均一化能够避免不准确的定量结果，并且可实现不同实验和不同样本检测结果之间的直接比较。用于real-time PCR miRNA检测数据均一化化的理想内参RNA应满足以下要求：

-研究所涉及的所有样本具有稳定的表达水平

-大小与被测miRNA相似

-表达水平与被测miRNA相似

-在实验条件下表达水平不会被调控

-内源性参比RNA和miRNA的引物应具有相似的扩增效率（接近100%）

QIAGEN的miScript PCR Controls满足以上各项要求，能够通过ΔΔCT方法对人类、大鼠、小鼠和狗等多物种的miRNA进行准确、可靠的相对定量。

QIAGEN在miRNA等非编码RNA的定量及功能研究领域均有十分全面的解决方案，适用于单细胞、循环体液、FFPE、exosomes等多种疑难样本中miRNA的全面研究，检测体系操作简单并完全经过实验验证，确保结果的准确获得。

二代测序/RNA-seq

毫无疑问，NGS将成为miRNA研究的主要方法。NGS的成本和所需时间已经显著下降，miRNA-seq对于很多实验室来说已不再高不可攀。NGS不会单纯取代其他技术，而是会与其他技术结合使用。测序结果需要验证，qPCR的可靠性使其成为结果验证的理想选择。当实验需要序列信息时，如发现新型miRNA、探寻isomiRs的影响、或区分miRNA与其他相似RNA序列，miRNA测序法便成为研究人员的不二之选。

芯片法

芯片法能够对一个样本中的多种miRNA同时进行分析(1)。微芯片的优势在于对miRNA的种类覆盖度和定制化检测。然而，其劣势包括：

-微芯片为半定量方法。因此尽管这种方法能比较不同细胞状态的miRNA相对表达水平，但需要另外验证，进行定量，验证方法包括RT-qPCR(1)

-此类实验需要特定仪器和软件

-这种方法只能用于已知种类的miRNA

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