科技前沿丨双光子显微镜「点亮」大脑

双光子显微镜「点亮」大脑

飞秒激光直接特异性 打开细胞 SOC 通道
 

光遗传学是一项结合遗传工程与光来操控神经细胞活性的技术，具有独特的高时空分辨率和细胞类型特异性，并且能够非侵入式的对神经元进行精准定位刺激操作，目前已成为神经科学研究中的一项重要技术手段。
 

但是，该技术需要利用基因操作技术将光感基因（如 ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch 或 OptoXR 等）转入到神经系统特定类型的细胞中，才能进而在不同光照条件下选择性地兴奋或者抑制神经细胞活性。
 

近期，上海交通大学贺号课题组在 Cell Research 上首次报道了使用双光子显微系统的飞秒激光直接特异性调控细胞的钙内流通道，并在体外和在体水平上对神经元钙离子信号进行了有效激发。

本文作者：田晓莹（贺号课题组）上海交通大学生物医学工程学院

光遗传学简史
 

斯坦福大学 Karl Deisseroth 实验室在 2005 年发明了光遗传学 (optogenetics，也译作光基因) 技术，通过向生命系统里转染对光敏感的离子通道蛋白，让细胞的离子通道对特定波段的光产生敏感性，进而可以使用外源光对神经细胞信号进行调控。

这项技术已经在神经科学，特别是脑科学的研究中取得了一系列重大的突破。通过光遗传技术，人类已经可以用光来控制动物的运动、进食、睡眠等基础生理功能，以及学习、情绪、记忆、遗忘、恐惧、社交等高等心理功能。

2015 年，Tank 课题组首次使用飞秒激光对光遗传蛋白进行双光子激发，实现了在体水平对单个神经元进行神经信号调控。这种单神经水平的精细调控将光遗传学技术进一步向精密、可控的方向牵引。

2019 年，Deisseroth 团队通过双光子荧光读取记忆神经元的信号，再通过飞秒激光激发神经元光敏蛋白调节的钙离子通道，可以将记忆中的视觉「植入 (inception)」到另一只小鼠中。

同年，Nature 报道了利用飞秒激光和光遗传学技术控制视觉皮层的几个关键神经元的钙离子通道，发现的视觉神经元的竞争机制，表明只需要几个关键神经元即可实现整个视觉功能；Cell 报道了使用飞秒激光对少量神经元光敏蛋白的刺激即可以有效控制小鼠的行为。

上述突破性的研究工作绝大多数都是由美国和欧洲的研究机构基于光遗传学技术完成。那么，细胞是否存在一种离子通道，可以直接被激光特异性调控呢？答案是肯定的。

钙离子以及 SOC 分子机制

钙离子作为真核细胞内广泛存在的第二信使，参与一系列的信号转导，进而调节许多细胞过程，如细胞外泌、能量供应、新陈代谢、基因转录等活动，对细胞免疫、增殖、分化、凋亡以及神经活动至关重要 [1, 2]。

几乎所有细胞中，钙池操纵性钙通道（store-operated Ca2 +，SOCs）是重要的钙内流通道 [3]。SOC 通道由两部分组成：位于细胞膜的 Orai1 通道和位于内质网的 STIM1 蛋白。

STIM1 的 N 端的 EF 部分感知到内质网内钙的大量降低后，会聚集在细胞膜附近，与细胞膜上的 Orai1 共价结合，使得 Orai1 形成六聚体从而引起钙内流，以维持细胞内的钙稳态 [4, 5]，如图 1 所示。
 

图 1. SOC 分子机制

飞秒激光直接激活 SOC

在之前的工作中，已有研究者利用光遗传工具来实现光对 SOC 通道的控制。如 Kyung 等将感光蛋白与 STIM1 进行结合，开发出称为 OptoSTIM1 的光遗传工具 [6]。以及 OptoCRAC 工具、LOca 工具都是通过将光敏蛋白间接或直接与 Orai1 结合，使用蓝光照射引起钙内流 [7 - 8]。

但是，上述的工具都是在光与细胞之间连接了一个外来工具来实现对 SOC 通道的控制。


那有没有办法能够直接利用光调控 SOC 通道呢？

对于这一问题，上海交通大学的研究人员提出了一种利用双光子系统直接调控 SOC 通道的方法，给出了肯定的答案。

这一方法在技术上实现极其简单，如下图所示，通过共聚焦或双光子显微系统将低功率 700 nm 的飞秒激光脉冲聚焦在细胞膜的 2×2 μm^2 的区域进行 60 毫秒的连续扫描，即可引起钙内流，并逐渐扩散至细胞胞浆及线粒体。

图 2. femtoSOC 实验方案
 

我们简称为 femtoSOC，双光子显微系统都可以实现 femtoSOC，所需的飞秒激光仅为几毫瓦，并且可以在刺激前后通过荧光实时观察各个亚细胞器内钙信号的变化。

图 3. Olympus 显微系统

文章进一步探究了飞秒激光照射引起钙内流的生化机制，如图 4 所示。利用双光子显微镜观察到 Orai1 靶定的钙敏感蛋白荧光上升，以及 flavin 自荧光发生改变，同时内质网 STIM1 无聚集现象且内质网处钙荧光无变化。
 

得出结论：飞秒激光诱导 flavin 于 Orai1 共价结合，引起 Orai1 形成六聚体，从而引起钙内流，并进一步调控下游信号通路如 ERK 等。

图 4.  飞秒激光照射引起钙内流的生化机制      

 飞秒激光激活新鲜脑片钙内流

该研究并进一步利用 femtoSOC 方法实现脑片神经元体外激活。从小鼠上获得的新鲜脑片（海马区，300μm 厚）置于双光子系统，使用新鲜灌流液保证其活性。位于脑片中间部位（150μ 深处）的神经元被飞秒激光刺激后立即发生钙内流，并且周围神经元也相继出现钙信号上升现象，如图 5 所示。

图 5. femtoSOC 激活新鲜脑片神经元钙信号

 飞秒激光在体调控小鼠神经元钙信号

此外，该项研究进一步利用双光子显微镜系统实现在体小鼠神经元刺激，利用立体定位向麻醉小鼠脑部注射 Cal-520/AM，用飞秒激光刺激 175μm 深度的神经元，观察到被刺激神经元以及周围神经元相继出现钙上升,  如图 6 所示。

图 6.  小鼠神经元在体实现 femtoSOC 

总结

这项工作实现了飞秒激活对 SOC 的直接激活，且任何一个双光子系统皆可实现，且可对刺激后细胞内的其他分子变化实时观察。

通过引入光敏蛋白，Deisseroth[9] 以及 Yuste[10] 等研究组已成功使用双光子光遗传技术，实现对老鼠植入幻觉以及特定行为的控制。

而 femtoSOC 不用转入外源基因，有望与现有的双光子光遗传系统有效地耦合，为神经领域的研究提供一个强有力的工具。

文中的光刺激及钙信号成像检测均可使用奥林巴斯双光子扫描显微 FVMPE-RS 实现。

该款多光子扫描显微镜，专为活体荧光成像设计，独.家的高速扫描振镜和高灵敏检测光路，配合同步光刺激系统，可在时间和空间上完美实现飞秒激光对神经元细胞的精确空间光刺激及钙信号的同步快速采集，准确灵敏捕捉每个转瞬即逝的信号。

此外，对于长时间的采集以及需要在刺激、成像任务之间进行切换的复杂程序实验，时序管理器软件模块可确保毫秒级精度。

神经细胞的膜电位变化是神经细胞的活动最基本的信号，FVMPE-RS 支持电生理实验模拟信号输入和 TTL I/O  信号。可拓展的 ANALOG 单元将外部电压信号记录为图像数据。可结合光遗传及电生理数据，更好地研究神经细胞活动。

何惧信号匆匆过隙，一切变化尽在掌握之中。我们的征程，是大脑内那片星辰大海。

参考文献：

1.D. E. Clapham, "Calcium signaling," Cell 131, 1047-1058 (2007).

2.M. J. Berridge, M. D. Bootman, and H. L. Roderick, "Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling," Nat Rev Mol Cell Biol 4, 517-529 (2003).

3.M. Prakriya, and R. S. Lewis, "Store-Operated Calcium Channels," Physiol Rev 95, 1383-1436 (2015).

4.C. Y. Park, P. J. Hoover, F. M. Mullins, P. Bachhawat, E. D. Covington, S. Raunser, T. Walz, K. C. Garcia, R. E. Dolmetsch, and R. S. Lewis, "STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1," Cell 136, 876-890 (2009).

5.N. I. Smith, S. Iwanaga, T. Beppu, K. Fujita, O. Nakamura, and S. Kawata, "Photostimulation of two types of Ca ²⁺ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation," Laser Physics Letters 3, 154-161 (2006).

6.T. Kyung, S. Lee, J. E. Kim, T. Cho, H. Park, Y.-M. Jeong, D. Kim, A. Shin, S. Kim, and J. Baek, "Optogenetic control of endogenous Ca 2+ channels in vivo," Nature biotechnology 33, 1092-1096 (2015).

7.L. He, Y. Zhang, G. Ma, P. Tan, Z. Li, S. Zang, X. Wu, J. Jing, S. Fang, L. Zhou, Y. Wang, Y. Huang, P. G. Hogan, G. Han, and Y. Zhou, "Near-infrared photoactivatable control of Ca(2+) signaling and optogenetic immunomodulation," Elife 4 (2015).

8.L. He, L. Wang, H. Zeng, P. Tan, G. Ma, S. Zheng, Y. Li, L. Sun, F. Dou, and S. Siwko, "Engineering of a bona fide light-operated calcium channel," Nature communications 12, 1-11 (2021).

9.J. H. Marshel, Y. S. Kim, T. A. Machado, S. Quirin, B. Benson, J. Kadmon, C. Raja, A. Chibukhchyan, C. Ramakrishnan, M. Inoue, J. C. Shane, D. J. McKnight, S. Yoshizawa, H. E. Kato, S. Ganguli, and K. Deisseroth, "Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception," Science 365 (2019).

10.L. Carrillo-Reid, S. Han, W. Yang, A. Akrouh, and R. Yuste, "Controlling Visually Guided Behavior by Holographic Recalling of Cortical Ensembles," Cell 178, 447-457 e445 (2019).