ZipChip微流控毛细管电泳-质谱联用方法对腺相关病毒的表征

下载地址: ZipChip微流控毛细管电泳-质谱联用方法对腺相关病毒的表征

简单、快速、完全自动化的分析方法； 不受样品种中性洗涤剂的干扰； 可以实现对腺相关病毒的不同病毒蛋白质的高效、快速分离，进而实现对腺相关病毒血清型的表征

方案详情：

重组腺相关病毒 (AAVs, adeno-associated viruses)由于其致病性差、免疫原性低、在多种组织中持续表达等特点，成为临床基因治疗领域的热门基因转移载(gene transfer vectors)。AAV 能够感染分裂细胞和非分裂细胞，并提供治疗基因的持续、长期表达。目前，AAV已被用于150多个正在进行的针对不同遗传疾病的临床试验。AAV 是一种小病毒，单链DNA基因组被包裹在衣壳中，可用于将DNA传递给靶细胞。特定的 AAV 血清型 serotype 优先传递特定的细胞类型或器官，因为每个AAV血清型具有不同的组织取向性、转导效率和抗原反应性。有13个人类和非人类灵长类AAV血清型和150多个基因型已经确定。此外，AAV 血清型 serotype 直接影响临床AAV基因治疗的有效性和安全性。

AAV 衣壳共含有三种病毒蛋白 (VPs，viral proteins)  的 60 份拷贝，三种病毒蛋白包括

VP1 (∼87 kDa)、VP2 (∼73 kDa)、VP3 (∼61 kDa)，其种群比例约为1:1:10，排列成一个二十面体结构，形成衣壳。这病毒蛋白共享一个共同的C端序列，整个 VP3 序列包含在 VP2 中，VP2 序列包含在 VP1 中。AAVs 与 VPs 之间的氨基酸序列有很高的同源性。此外，据报道，在衣壳蛋白中即使是单个氨基酸的变化，也会改善免疫原性较低的转导。因此，目前对能够确定AAV血清型和检测序列上的微小差异如单残留变异的方法具有高度需求。

2009年研究人员提出了一种基于质谱肽定位的衣壳同一性检测方法（J. Virol. Methods， 2009，159：167–177）。该方法能根据不同 AAV 血清型的蛋白水解产物的质量差异来区分不同的 AAV 血清型。与野生型AAV相比，它还能检测到单氨基酸突变。然而，这种方法需要血清特异性蛋白酶和相对复杂的样品制备步骤，包括进行变性凝胶、凝胶内消化、LC-MS/MS分析和数据库检索。最近，金等人介绍了一种直接的 LC/MS 完整蛋白质分析方法来表征各种AAV血清型中的VPs（Hum. Gene Ther. Meth., 2017, 28: 255–267）。该方法包括样品制备、LC/MS和数据分析4小时，比蛋白质消化法至少快6倍。然而，由于蛋白质浓度较低，样品的制备还需要进行包括预浓缩和缓冲液交换的步骤。

微流控芯片和毛细管电泳在蛋白质的分离、分析和表征方面具有巨大的应用潜力。ZipChip 是美国908Devices 公司开发出的全新的基于微流控芯片的毛细管分离平台，通过与高分辨质谱仪的联用，可以实现生物蛋白大分子的快速、高效的分离。近期的多篇文章报道了ZipChip CE-MS 用于表征完整抗体分子以及抗体电荷变异体、N-糖基化谱监测、糖型分析和滴度测定等应用。

本解决方案提供了一种简单、快速、全自动的微流控芯片CE/MS方法，用于从AAV样本中识别VPs，以支持重组AAV基因治疗的发展。以野生型 AAV2 和含有三个酪氨酸(Y)到苯丙氨酸(F)突变的AAV2突变体为测试样品，所有的仪器为908Devices 公司的ZipChip 离子源结合Thermo Fisher 公司的Q Exactive HF质谱仪，如图1所示，采用的芯片为908Devices公司ZipChip HR 芯片和背景缓冲溶液为ZipChip Peptide 试剂盒。

采用ZipChip CE-MS区分样品中的变异体，成功地分析了野生型AAV2和AAV2突变体在三个氨基酸上的差异，并准确地确定了VPs的相应质量，如图2所示。根据所测到的准确的蛋白序列，对N端和C端序列进行了鉴定，进一步验证了该方案的可靠性。ZipChip分离是基于电泳迁移率的差异，电泳迁移率取决于分析物的电荷和尺寸。带正电荷的分析物在电场作用下进入微流控毛细管分离通道并沿着通道向ESI 喷雾端迁移，而中性和带负电的成分从分离通道回流至废液池。因此，ZipChip的另一独特优势是可以将中性洗涤剂聚山梨酸盐polysorbate 20从样品中分离出来，以避免洗涤剂对MS检测的离子抑制影响。

这种快速分析方法允许直接分析稀释的、低浓度的样品，能够从含有多山梨酸盐的配方缓冲液中直接分离，并且消耗的样品量非常少（1-20纳升），这些都是潜在的样品受限而需要考虑的重要因素。综合考虑，这种基于微流控技术的芯片毛细管电泳-质谱联用技术（ZipChip CE-MS）可作为AAV血清型鉴定或病毒蛋白异质性监测的快速筛选方法，以支持重组AAV基因治疗的发展。