荧光蛋白简介

GFP（绿色荧光蛋白）或其变体的光谱特性取决于构成发色团的氨基酸结构（图 1）^[2]。这可能是位于 65-67 位的三个氨基酸或靠近该位置的残基（如 YFP）。除了有关发色团的主要突变外，还进行了其他定点诱变研究，以改善蛋白质成熟和在异源细胞系统中表达等其他因素（如密码子使用、蛋白质在生理温度下的折叠）。请注意，维多利亚甲虫是一种相对原始的外温海洋生物，没有调节体温的生理系统。

尽管 GFP 因其亮度和高光稳定性而成为最受欢迎的荧光粉之一，但它也有两个主要缺点：对 pH 值有一定的敏感性和轻微的二聚倾向。二聚化或寡聚化是许多 FP 的一个问题。它们相互凝集的倾向会产生假象或误解融合蛋白的位置和功能。不过，科学家们也找到了一些解决这一问题的办法。在关键位置（F223R、L221K 和 A206K）的非极性氨基酸被亲水性氨基酸取代后，二聚化程度降低^[3]。所有能改善光谱和实际特性的基因改变都被归纳为"增强型"FP。

就 wtGFP 而言，增强后的 EGFP（增强型 GFP）在 488 纳米波长处只有一个激发峰，而不是以前在 395 纳米波长和 475 纳米波长处的复杂吸收光谱^[2,3]。Roger Heim、Douglas Prasher 和 Roger Tsien 开发的第一种 wtGFP 突变体（S65T 突变体）的亮度是原来的五倍，而且成熟时间更短^[3]。加上另一个突变体（F64L）在 37°C 温度下的成熟效率更高，这对于观察活细胞的人来说具有重要作用。

蓝宝石（Sapphire）^[3]是一个非常有趣的 GFP 变体，它的斯托克斯位移最大。靠近发色团的一个位置发生了突变（T203I），导致激发最大值变为 399 纳米，发射最大值变为 511 纳米。这就是 112 纳米的斯托克斯偏移。Emerald 是另一种  GFP 改造品，它能提高光稳定性和亮度，并能在哺乳动物细胞中更有效地折叠^[3]。

所有绿色荧光蛋白都具有相对较高的亮度，而蓝色荧光蛋白在显微应用中通常会降低发射强度。尽管如此，由于具有其他光谱特性，它们仍被用于光学检测。EBFP（增强型蓝色荧光蛋白）是通过对 wtGFP 进行几轮突变而构建的^[3]。第一个突变（Y66H）使发射峰从绿色变为蓝色。随后更多的突变产生了一种激发最大波长为 380 纳米、发射最大波长为 448 纳米的蛋白质。这些光谱特性使其成为 EGFP 在 FRET 显微镜下的搭档。最近，Azurite，SBFP2和 EBFP2 等蓝色荧光蛋白具有更高的量子产率和更好的光稳定性^[3]。EBFP 的后继者是一种名为 Sirius 的蛋白质，这种蛋白质对 pH 值的耐受性非常高（在 pH 值 3 到 9 之间都很稳定），而且是迄今为止发射波长最短的荧光蛋白，因此很受欢迎^[3]。

第二类 "蓝色" GFP 变体是由青色荧光蛋白 (CFPs)形成的^[3]。用色氨酸取代酪氨酸（Y66W）并进一步改变基因，可产生亮度和光稳定性更好的荧光色素。这种 ECFP 在 433/445 纳米和 475/503 纳米具有双峰激发和发射光谱。亮度仅为 EGFP 的 40%。Cerulean 是 ECFP 的一个重要变体，它具有更高的消光系数和量子产率 ^[3]。它的亮度是 ECFP 的 1.5 倍，被用作 YFP 的 FRET 伴侣。

GFP 的突变并不直接改变发色团三个中心氨基酸中的一个，因此出现了黄色荧光蛋白（YFP）^[3]。YFP 在 203 位有一个共同的苏氨酸，该位置被一个酪氨酸（T203Y）取代。该氨基酸是 β 管的一部分，靠近发色团。与 GFP 相比，EYFP 的激发和发射特性已转向更长的波长，其激发和发射最大值分别为 514 纳米和 527 纳米（EYFP）。EYFP 的一个特点是对 pH 值敏感。在 pH 值为 6.5 时，EYFP 只有约 50%的荧光，但这并不总是一个缺点。在测量 pH 值（如囊泡、内体等）时，EYFP 可用作指示剂。有趣的是，进一步的突变（Q69M）产生了更好的酸稳定性并显著提高了亮度（比 EGFP 亮 75%）。与 EGFP 相比，这种蛋白质的光稳定性仍然较差，因此被称为Citrine ^[3]。另一种 YFP 突变体（F46L）的成熟速度大大加快，耐酸碱性也有所提高。这种蛋白质被命名为 Venus，是 Cerulean 的一种常见 FRET 受体 ^[3]。

如上图所示，来自维多利亚水母的大多数荧光蛋白发出的光谱为蓝色至黄色。红色荧光蛋白则不见踪影。俄罗斯科学家谢尔盖-卢基扬诺夫（Sergey Lukyanov）发现了拟水螅中的荧光蛋白，填补了这一空白^[4]。与其他荧光蛋白相比，红色荧光蛋白（RFPs）具有很大的优势，因为在光谱的红色部分，细胞中的自发荧光要少得多^[3]。此外，它们能被较长的波长激发，这对活细胞更有利，因为较短波长的光对标本的损害更大。与水母蛋白相比，珊瑚蛋白的另一个普遍优势是它们能在 37°C 温度下高效成熟。维多利亚A. GFP及其衍生物必须经过基因改造才能以正确的方式折叠，而动物蛋白的成熟则无需分子工程。这可能是由于其生物群落的水温较高。

在拟水生动物中发现的第一种 FPs，也是目前使用最多的 FPs 之一是 DsRed^[3]。其名称来源于海葵 Discosoma striata。DsRed 的激发最大波长为 558 nm，发射峰值为 583 nm。然而，当其结构信息公布后，最初的兴奋就停滞不前了。DsRed 的成熟速度比水母 FP 慢得多，并且有一个中间发色团阶段。这一阶段发出的光为绿色光谱，会与其他 FP 重叠。GFP 部分已经提到，DsRed 还有另一个问题。海葵红色荧光蛋白是一种强制性四聚体，容易形成寡聚体。这可能导致对融合蛋白的位置和功能产生误解。一般来说，安氏无脊椎动物的 FPs 与维多利亚无脊椎动物的 FPs 具有相似的结构。发色团隐藏在大小为 4 nm x 3 nm（高 x 直径）的 β 管状结构中。不同之处在于安氏囊虫的 β-桶状结构更像椭圆形（图 2）。

在 GFP "进化" 的同时，研究人员开始对原始 DsRed 进行改造，以克服其结构缺陷。第二代 DsRed--DsRed2--减少了寡聚体的形成趋势，加快了成熟速度，最大限度地减少了绿色发光的中间阶段^[3]。进一步的诱变导致红色 FP 完全失去了四聚体状态，但也丧失了部分量子产率（DsRed2 的 25%）。钱氏实验室的这项工作产生了第一个单体红色荧光蛋白，因此他们称之为 mRFP1 ^[3]。

随后，以这种 mRFP1 为起点，产生了一组六种单体 FP，统称为 "mFruit" ^[3]。它们各自的名称源自其发射颜色：mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。mCherry 是这些 FPs 中最有用的一种，它在 610 纳米范围内发光，亮度是 EGFP 的 50%。

迄今为止最耀眼的 FP 是 mFruit 派系的追随者，名为 tdTomato ^[3]。在基因改变之前，dTomato 是一种强制性二聚体，但通过将两个二聚化伙伴放在一个分子中，避免了二聚化。两个 dTomato 单元通过 12 个氨基酸连接体耦合，形成串联二聚体 FP tdTomato，其发射最大值为 581 纳米，在光谱的最高区域具有光稳定性。

mPlum是所有 mFruit 蛋白中红色发射最深的一种，发射波长为 649 nm ^[3]。

科学上使用的绿色荧光类动物蛋白数量非常少，这并不令人惊讶，因为我们已经有了众所周知，使用方便的维多利亚虫 GFP。显然，没有人认为有必要建立一种新的绿色荧光蛋白。尽管如此，还是有一些新的绿色荧光蛋白出现了，比如石珊瑚中的一种明亮荧光蛋白--Azami Green ^[3]。有趣的是，它与 EGFP 的序列同源性不到 6%。

Katushka 是一种对深部组织成像具有重大影响的拟态荧光蛋白 ^[3]。通过对来自 E. quadricolor 的 RFPs 进行诱变，发现 Katushka 是一种二聚体蛋白，在 635 纳米波长处具有最大发射亮度，是所有深红色荧光蛋白中亮度最高的。Katushka的单体形式被称为 mKate，后来被提供了更高亮度的 mKate2 ^[3]。

总之，今天用于显微应用的所有荧光蛋白都来自原始海洋生物。表 1 列出了最重要的荧光蛋白及其相关光谱特性，如激发和发射最大值、光稳定性、量子产率和亮度。

表 1：荧光蛋白的光谱特性 (数据来源为参与文献 6)。