高效液相色谱实验技术问题解答

A-01000  小鼠抗3-磷酸甘油醛脱氢酶单克隆抗体（内参抗体）  Anti-GAPDH（mouseAnti-GAPDHMonoclonal）        
A-01001  β-肌动蛋白抗体（内参抗体）  Anti-β-Actin        
A-01002  14-3-3 蛋白抗体   Anti-14-3-3protein        
A-01003  14-3-3蛋白抗体（植物）  Anti-14-3-3 familyprotein（Malus domestica （Apple） （Malussylvestris））        
A-01004  2，4-二氯苯氧乙酸/除草剂/激素型除草剂抗体  Anti-2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid）        
A-01005  2，4-二氯苯氧乙酸/除草剂/激素型除草剂单克隆抗体  Anti-2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid）        
A-01006  5-羟色胺抗体  Anti-5-HT（5-hydroxytryptamine）        
A-01007  5-羟色胺受体1A抗体  Anti-5-HTR1A （5-HT1A（5-hydroxytryptamine/serotonin receptor 1A; 5HT1a; ADRBRL1;ADRB2RL1;HTR1A）        
A-01008  5-羟色胺受体1B（5-HT/serotoninR1B）抗体  Anti-5-HTR1B （5-hydroxytryptamine/serotoninreceptor 1B）        
A-01009  5-羟色胺受体2B（5-HT/serotoninR2B）抗体  Anti-5-HTR2B（5-hydroxytryptamine（serotonin）receptor2B）        
A-01010  5-羟色胺受体2A抗体  Anti-5-HTR2A        
A-01011  5-羟色胺转运蛋白抗体  Anti-5-HTT/SERT（Serotoninreuptaketransporter）        
A-01012  5-羟色胺受体3抗体  Anti-5-HTR3（5-hydroxytryptamine（serotonin） receptor3a）        
A-01013  5-羟色胺受体4抗体  Anti-5-HTR4（5hydroxytryptamine serotonin receptor4）        
A-01014  5-脂氧合酶抗体  Anti-5-LOX（5-lipoxygenase）        
A-01015  8-羟基脱氧鸟苷抗体  Anti-8-OHdG（8-Hydroxy-2＇-deoxyguanosine;8-Hydroxydeoxyguanosine）        
1、高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的?

解：气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱仪的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏渡得到启发，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱曲缺点，从而达到高效、快速、灵敏。

2、与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足?

解：气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。因此它只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。而高效液相色谱由于以液体作为流动相，只要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度，便可以分析，所以适用性广，不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物，例如，生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。在目前已知的有机化台物中，

只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离，80%的有机化合物要用高效液相色谱分析。

气相色谱仪中流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用、而高效液相色谱的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲合力，可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性，另外可作流动相的化合物多，选择余地广。

与气相色谱相比，高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易，只要开口容器放在柱子末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集。回收是定量的，可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。

高效液相色谱不足的是，日前检测器的灵敏度不及气相色谱。必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。

3、试比较气相色谱与液相色谱的H-u曲线，分析产生不同的原因。

解：可看出，气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线，形状迥然不同，流动相的流速对柱效的影响也不一样，在气相色谱的H-u曲线上，塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一最低点，这时柱效最高，板高最小，流速最佳。而液相色谱H-u曲线，未出现流速降低板高增加的现象，由于最佳流速趋近于零，一般观察不到最低板高相对应的最佳流速。在正常的情况下，流速降低，板高H总是降低的，这与气相色谱明显不同。在气相色谱中流动相流速增大，柱效呈直线降低，而在液相色谱中，流动相流速增大，柱效平缓降低。其主要原因是液相色谱的流动相为液体，液相的扩散系数Dm很小，通常仅为气相扩散系数的104~105分之一，所以分子扩散项在低u时也不起多大作用、因此液相色谱H-u曲线未能出现流速降低，板高增加现象。到高速时，虽然柱内线速提高，但固定相和流动相的传质都能很快进行，故H-u曲线上升缓慢。

4、简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谙带扩张、提高柱效?

解：液相色谱中引起色诺峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。

在液相色谱中要减小谱带扩张，提高柱效，要减少续料颗粒直径，减小境料孔穴深度，提高装填的均匀性，采用低粘度溶剂作流动相，流速尽可能低，同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。

5、为什么要提出折合参数?有何特点?

解：我们知道色谱操作条件对板高是有影响的.Giddings发现，固定相相同，填充良好，共是粒度dp不同，因而H-u曲线不同，在液相色谱中，培板高度是粒度的函数，为了比较不向色谱条件下的板高H.提出折合参数，包括折合板高、折合流速、折合柱长。其特点是对于不同粒度的填料能得到相同的H—ur曲线，因此可以在相同的条件下比较不同填料的柱效。

6、液相色谱柱A长度为15cm，载体粒度为5m.另一B柱长为30cm，载体粒度为10m，两柱的柱效相等吗?

解：A柱的折合柱长为30000，B柱的折合柱长也为30000，表明组分在两根柱内从柱人口到出口都经过30000个载体颗粒.两校的柱效相等。

7、何谓梯度淋洗，适用于哪些样品的分析?与程序升温有什么不同?

解：梯度淋洗就是在分离过程中.让流动相的组成、极性、pH值等按‘定程序连续变化。使样品中各组分能在最佳的k下出峰。使保留时间短、拥挤不堪、甚至重叠的组分，保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离，特别适合样品中组分的k值范围很宽的复杂样品的分析。梯度淋洗十分类似气相色谱的程序升温，两者的目的相同。不同的是程序升温是通过程序改变柱温。而液相色谱是通过改变流动相组成、极性、pH值来达到改变k的目的。

8、流动相为什么要预先脱气?常用的脱气方法有哪几种?

解：流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处，气泡进入检测器，引起光吸收成电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测;溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应;溶解气体还会引起某些样品的氧化降解.对分离和分析结果带来误差。因此，使用前必须进行脱气处理。常用的脱气法有以下几种：（1）加热脱气法;（2）抽吸脱气法;（3）吹氦脱气法;（4）超声波振荡脱气法。

9、按固定相孔径大小分类，液相色谱固定相有哪几类?各有什么特性及适用范围?

解：从固定相的孔隙深度考虑，液相色谱固定相分为表面多孔型（薄壳型）和全多孔型（全孔型）两类。

表面多孔型固定相多孔层厚度小.孔浅，相对死体积小，出峰迅速，柱效高，颗粒较大，渗透性好，由于孔浅，梯度淋洗时，当流动相成分改变后.孔内外流动相成分能迅速达到平衡，机械强度高，装柱容易，其不足的是由于多孔层厚度小，因而柱容量小，最大允许样品量受到限制，适用于比较简单的样品分析及快速分析。