固相萃取高效液相色谱法检测生物样本中甲氨喋

目的：建立生物样品中甲氨喋呤(MTX)浓度测定方法。方法：固相萃取装置和富集样品，高效液相色谱法测定血清和脑脊液中MTX含量。色谱条件：以C18柱为分析柱，流动相为甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(2 ∶7∶91)，流速0.8 mL.min-1，柱温25 ℃，检测波长313 nm。结果：在0.05～80 μg.mL-1范围内呈线性，回收率为90%以上， 血清中MTX最低检测限为10 ng.mL-1，脑脊液中最低检测限为5 ng.mL-1。结论：本法简便、快速、灵敏度高、特异性强，适合于生物样品中MTX监测 及药物动力学研究。
关键词　固相萃取　高效液相色谱　甲氨喋呤　急性淋巴细胞白血病

　　监测体液中甲氨喋呤(methotrexate,MTX)浓度，指导其对抗药亚四氢叶酸(folinic aci d,CF)的合理使用，是儿童急性淋巴细胞白血病MTX/CF大剂量疗法中公认的必要措施。生物样品中MTX的测定方法有荧光分光光度法［1，2］、酶抑法［3］、放免法［4］和微生物法［1，5，6］，但都存在专属性差等缺陷，MTX代谢物和叶酸同类物干扰测定，因而结果的准确性差。现在大多采用荧光偏振免疫法测定，但其特异性差，而且试剂盒依赖进口，价格昂贵，其监测很难与临床治疗同步。高效液相色谱法能对MTX和代谢产物进行分离和测定，因而其特异性和准确性优于上述方法。高效液相色谱法测定生物样品(血清和脑脊液等)中MTX，主要受样品预处理方法的限制，文献报道的预处理方法有离子对 萃取［6，7］、采用Seppak小柱处理［8］、乙腈和甲醇去蛋白后直接进样 ［9］等方法，但回收率均介于38%～63%之间，且极不稳定；为了提高灵敏度 ，进样量均为100 μL，由于杂质去除不完全，导致色谱柱严重污染，限制了该方法的使用。我们通过反复摸索，采用固相萃取净化和富集样品，反相高效液相色谱法测定血清及脑脊液中MTX，回收率达90%以上且非常稳定，方法简便、快速、特异性高、专属性强、灵敏度高，完全 能满足临床监测及药物动力学研究的需要。

1　仪器与材料

　　HP1100系列高效液相色谱仪(美国惠普公司)；DL-1型固相萃取器、Spe柱(中国科学院大连化学物理研究所)；WH-1型旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)；MTX对照品(0138-9702，定量分析用，中国药品生物制品检定所)；甲醇和乙腈均为色谱纯，水为重蒸馏水；0.9%氯化钠注 射液(本制剂室生产)，其它试剂为分析纯。

2　实验方法与结果

2.1　色谱条件　色谱柱为ODS Hypersil(5 μm,250 mm×4.6 mm)，流动相为甲醇-乙腈-7%磷酸二氢钠和1%枸橼酸缓冲液(2∶7∶91，)，流速0.8 mL.min-1 ，柱温：25 ℃，检测波长：313nm，进样量：20 μL。色谱图见图1。血清及脑脊液中内源性杂质对MTX检测无干扰，MTX及其代谢产物均达到基线分离，保留时间分别为14.3 min和 15.4 min ，色谱分析在18min内完成。

图1　4.33 μg.mL-1 MTX 对照品溶液(A)和ALL患儿
用MTX(3 g.m-2 iv)24 h时血清(B)及
2.5 h时脑脊液(C)的色谱图
1.MTX　2.MTX代谢物

2.2　标准曲线制备　精密称取于100 ℃减压干燥至恒重的MTX对照品5 0 mg,置50mL量瓶中，用甲醇定容，再以50%甲醇制成0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5 .0，10，20，40，80μg.mL-1系列标准溶液，取20　μL进样测定，以浓度(C) 对峰面积(A)进行回归处理，得回归方程：
A=44.87C+2.01　r=0.999 9
结果表明MTX在0.05～80 μg.mL-1范围内线性关系良好。