气相色谱-质谱联用和光谱相关色谱法用于清肝注射液及茵陈药材中挥发性成分

清肝注射液具有清热利湿、利胆退黄之功效［1］，在临床上已得到广泛应用，其挥发性成分主要来自茵陈药材。茵陈（HerbaArtemisiaeScopariae）为传统中药［2］，临床上被广泛用于治疗黄疸、肝炎等疾病，其挥发油具有广谱抗菌和杀菌作用［3］。在中药制剂的质量控制中，注射液中有效成分的来源，即其与对应药材的相关性十分重要。中药及其注射液的成分非常复杂，即使用正交投影法（OPA）［4］，子窗口因子分析法（SFA）［5］，直观推导式演进特征投影法（HELP）［6，7］等二维数据分辨方法进行解析后与标准谱库进行匹配，也不能将所有物质定性。在组分不完全清楚的情况下，本实验充分利用联用色谱的色谱、质谱信息，结合光谱相关色谱法［8］，对相同条件下所得的清肝注射液和茵陈药材挥发性成分的数据进行了详细的对比。报道如下。

　　1  仪器与试药

　　GC-9160型气相色谱仪，挥发油提取器。

　　清肝注射液（批号：040607）和茵陈药材均由江西省天施康中药股份有限公司提供；正己烷为分析纯，水为蒸馏水。

　　2  方法

　　2.1 方法原理相同条件下所得的两个色谱曲线，虽然同一流出组分的保留时间可能存在漂移，但其光谱（或质谱）应该相同或相似。因此，通过对不同流出时间点的光谱（或质谱）进行相关计算，可得一个类似气相色谱的光谱相关系数曲线，称之为光谱相关色谱［8］。

　　一般说来，两个组分的光谱相关系数可由下式计算：

　　r（i,j）=（si-i）T（sj-j）ll（sj-j）ll（sj-j）ll         （1）

　　式中- 1 ≤  ≤1 ， r越大表示组分i的光谱（或质谱）si 与组分j 的光谱（或质谱）Sj 越相似。当r =1 且保留时间相近时，色谱曲线中的两个组分应为同一化学物质。实际上，由于噪声和量测误差等因素的存在， r最大值不可能等于1，只能接近于1。‖·‖表示Frobenius 范数， T为向量的转置，变量上的一横表示相应变量的均值。

　　设某一样本化学色谱指纹图谱的某一组分纯物质质谱为s,另一样本色谱指纹图谱所包含的所有质谱,即每一保留时间点所对应的质谱，记为xj（ j = 1 , . . . , m , m 为最大色谱保留时间点） ，计算s与xj的相关系数即可得相对于该纯物质的光谱相关色谱，根据式（1） 计算如下：

　　r（s,xj）=（s-）T（xj-j）ll（s-）llll（xj-j）ll        （2）

　　将r （ s , Xj）对色谱保留时间作图即得到该目标物质与这一样本色谱指纹图谱的光谱相关色谱曲线。如果色谱流出时间方向上所对应的一段光谱相关色谱曲线的值很接近1，则说明目标物质存在于该样本，再结合色谱保留时间信息即可实现相同条件下样本的相关性分析。

　　2.2   供试品溶液的制备量取注射液50 ml（或称取药材12.5g），置于圆底烧瓶中，加玻璃珠数粒，连接挥发油提取器。挥发油提取器的收集管中上端加水，使充满刻度部分，再加正己烷1ml，连接回流冷凝管，适当温控提取。从回流开始计时，控制温度使每分钟约20滴。60min后停止加热，冷却，收集含有挥发油组分的正己烷溶液。用正己烷定容至2 ml，即得。所用药材的量与注射液的浓度一致。

　　2.3   色谱条件

　　2.3.1  GC条件OV-1弹性石英毛细管柱30 m×0.25 mm×0.25μm，进样口温度250℃，载气为N2，流速0.70 ml·min-1，分流比5∶1，程序升温起始温度为60℃ （保持5min），然后以4℃·min-1的速度升温至240 ℃（保持5 min），进样量1μl。

　　2.3.2  MS条件电离方式为EI源；电子能量0.75 kv；离子源温度200℃；质量范围（m/z）30～400amu；扫描间隔0.2 s/scan。

　　3  结果

　　3.1 茵陈药材与注射液中挥发性成分定性、定量分析采用GC/MS联用技术，对茵陈药材和清肝注射液中的挥发性成分进行分析，分别分离出28个和23个主要成分。将所得各成分的质谱图，直接用该机的数据系统进行检索（谱库NIST107），并用标准图谱比较，确定其成分。用岛津公司GC/MS工作站中的峰面积归一化法，测定各成分的相对百分含量。定性、定量结果见表1。表1 清肝注射液和茵陈药材中挥发性成分定性、定量结果%表1中第1列左边数字表示在茵陈中的峰号，右边数字表示在清肝注射液中的峰号；“-”表示未被检出

　　3.2  茵陈药材与清肝注射液中挥发性成分的相关性分析

　　a茵陈药材中挥发性成分的TLC  b清肝注射液中挥发性成分的TLC

　　图1为茵陈药材和清肝注射液中挥发性成分的总离子流图（TLC），它们均是很复杂的分析体系,大部分色谱峰都达到基线分离，但也有些色谱峰出现重叠现象。对于已得到定性结果的谱峰，根据二者的色谱保留时间以及定性分析结果可以确定其相关关系及归属问题。对于匹配率较低的谱峰，如清肝注射液中的15号、17号和18号峰，采用光谱相关色谱的方法来确定它们的对应关系。

　　在相关色谱分析前，首先要得到各谱峰的纯质谱。17号和18号峰均为纯峰，各色谱流出点对应的质谱图均相同。因此，任取其中的一点对应的质谱即可得到其纯质谱。由于15号峰不纯，首先要确定纯物质区域，这可以通过二维数据解析［6，7］获得。其纯物质区域各点对应的质谱为纯质谱。在实际计算中，为了避免噪声和计算误差的影响，我们一般选取色谱响应值最高的点附近的一段区域，进行重复计算得到光谱相关色谱。

　　如清肝注射液中18号峰与药材中对应谱峰的确定。清肝注射液中18号峰的纯质谱，记为S1。根据公式（2）对茵陈药材数据中保留时间为35.5～40min的部分作相关色谱分析，可得注射液中18号峰与茵陈药材图谱的光谱相关色谱（见图2）。在光谱相关色谱中，35.5～40min的相关系数值最大为0. 998 8，很接近1，其对应的色谱流出时间与茵陈药材的24号峰的一致，这说明清肝注射液中的组分18与茵陈药材图谱中组分24的质谱十分相似,应为同一物质（见图3～4）。用相同方法对清肝注射液中的15号和17号峰与茵陈药材图谱中组分的对应关系进行分析，确定其分别与茵陈药材谱图中的21号和23号谱峰相对应。

　　清肝注射液中的23个主要成分中除4号和21号峰外，其余均来源于茵陈药材。4号峰和21号峰对应的物质可能来源于助溶剂吐温-80，但进一步的确认还需要实验的证明。茵陈药材中挥发性成分的最高响应值约为清肝注射液中物质最高响应值的7倍。可见，厂家完全可以改进工艺提高药材中挥发性成分的提取率。