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固相萃取法和凝胶渗透色谱法测定鳗鱼中苯并咪唑类药物残留

发布时间: 2010-04-07 09:31 来源:上海禾工科学仪器有限公司
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固相萃取法和凝胶渗透色谱法测定鳗鱼中
苯并咪唑类药物残留
林永辉,李耀平*,陈祥明,杨 方,刘正才,苏芝娇
(福建出入境检验检疫局技术中心,福建 福州 350001)
摘 要:分别采用固相萃取法(SPE)和凝胶渗透色谱法(GPC)对样品进行净化,采用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)
检测,建立两种不同前处理方法的鳗鱼中六种苯并咪唑类药物(甲苯咪唑、阿苯哒唑、硫苯咪唑、氧化丙硫咪唑、
氟苯哒唑、丙氧咪唑)残留检测方法。两种检测方法对6 种苯并咪唑类药物在三个添加水平(2.0、4.0、8.0μg/kg)上
的8 次重复实验表明,两种方法的检测都可以达到2.0μg/kg,回收率在70%~110%,RSD 值都小于15%,符合残
留检测的要求。
关键词:苯并咪唑;固相萃取;凝胶渗透色谱;液相色谱串联质谱
Solid Phase Extraction and Gel Permeation Chromatography for EelSample Pretreatment for Determination of
Benzimidazole Anthelmintics Residues in It by Liquid Chromatographyand Tandem Mass Spectrometry
LIN Yong-hui,LI YAO-ping*,CHEN Xiang-ming,YANG Fang,LIUZheng-cai,SU Zhi-jiao
(Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and QuarantineBureau, Fuzhou 350001, China)
Abstract:The eel samples were purified by solid phase extraction(SPE) and gel permeation chromatography (GPC)
respectively, and then benzimidazole anthelmintics residues in themwere determined by liquid chromatography and tandem
mass spectrometry (LC-MS-MS) method. Therefore, two detectionmethods with two different pre-treatments were developed
and compared for the quantitative determination of residues of sixbenzimidazole anthelmintics including mebendazole (MEB),
albendazole (ALB), oxibendazole (OXI), oxfendazole (OXF),fenbendazole (FEN) and flubendazole (FLU). The results of eight
repeated tests for three levels (2.0, 4.0 and 8.0 μg/kg) of sixbenzimidazole anthelmintics showed that both of detectionlimits
of two methods are below 2.0 μg/kg, and both of recoveries arebetween 70% and 110% with a RSD of less than 15%. All of these
indexes accord to the requirements of the residue detection.
Key words:benzimidazole;solid phase extraction (SPE); gelpermeation chromatography (GPC); liquid
chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS-MS)
中图分类号:TS201.6 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2009)08-0177-05
收稿日期:2008-06-18
基金项目:福建省科技计划重点项目(2006N0001)
作者简介:林永辉(1980- ),男,助理工程师,硕士,研究方向为食品安全检测。E-mai l:
xmulyh@163.com
* 通讯作者:李耀平(1963-),男,高级农艺师,硕士,研究方向为水产品残留检测与监控。E-mail:lypfjfz2007@126.com
苯并咪唑类药物是一种现代广谱、高效率、低毒
抗蠕虫药,包括甲苯咪唑(mebendazole,MEB)、阿苯
哒唑(albendazole,ALB)、丙氧咪唑(oxibendazole,
OXI ) 、奥芬达唑( o x f e n d a z o l e ,OXF ) 、芬苯达唑
(fenbendazole,FEN)、氟苯哒唑(flubendazole,FLU)
等。该类药物特别对胃肠线虫具有强驱杀作用,目前
被广泛用于治疗鱼类指环虫病、伪指环虫病、三代虫
病等寄生虫病,有明显疗效[ 1 - 3 ]。
苯并咪唑类药物在实验动物和靶动物上显示致畸和
致突变作用,目前使用的苯并咪唑类药物多数仍然是食
品残留中重要的监控对象。我国以及联合国粮农组织、
欧盟、美国、日本等国家和组织都将苯并咪唑类药物
列入限制使用的兽药药物中[4 ]。
目前文献报道的苯并咪唑类药物残留检测方法大多
采用固相萃取柱(solid phase extraction,SPE)方法净化,
高效液相色谱法检测[ 5 -8 ]。其样品前处理过程复杂,不
易控制。凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,
GPC)法是目前逐渐被广为使用的、新的前处理方法,具
2009, 178 Vol. 30, No. 08 食品科学※分析检测
有省时、方便,环境污染小,有效去除色素和脂肪等大分
子的特点。本实验室拟采用固相萃取法(SPE)和凝胶渗透色谱
法(GPC)对样品进行净化,采用液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)
检测,以期建立苯并咪唑类药物残留检测的新方法。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
鳗鱼 市售。
乙腈、甲醇、二甲亚砜为色谱纯;乙酸乙酯、环
己烷、正己烷、氨水、甲酸为分析纯;甲苯咪唑、
阿苯哒唑、丙氧咪唑、奥芬达唑、芬苯达唑、氟苯
哒唑均购自S i gm a 公司,以二甲亚砜溶解,配置成
100mg/L 储备液,- 4℃冷冻储藏,使用时根据需要用
流动相稀释成标准工作曲线,流动相为50% 乙腈溶液。
Waters ACQUITY UPLC-Micromass Quattro Premier
XE 超高效液相色谱- 串联质谱仪;J 2 S c i e n t i f i c
AccuPrepTM 凝胶渗透色谱仪,色谱柱填料Bio-Beads SX3;
固相萃取小柱:Angi lent Amino(NH2) SPE 柱
(200mg/3ml),CHR OMABOND NH2 SPE 柱(500mg/3ml),
Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 色谱柱。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
鳗鱼取连皮的鱼肉,将皮、肉分离后取鱼皮置于
微波炉中解冻后连同鱼肉、鳗鱼制品(取所有可食部分)
一并放入高速组织捣碎机15000r/min 均质2min,充分混
匀,装入清洁容器内,并标明标记。
1.2.2 液相色谱分离条件
C18 色谱柱(100mm × 1.0mm,1.7μm); 柱温35℃;
样品盘温度22℃;流速0.300ml/min;流动相:A 液为水,
B 液为乙腈;梯度洗脱:0~0.5min,85% A;1~4.5min,
85% A~20% A,6# 梯度曲线(直线下降); 4.5~5.0min,
20% A~85% A,6# 梯度曲线;5.0~5.5min,85% A。
1.2.3 质谱条件
ESI+ 模式;萃取锥孔电压5.00V;雾化气温度400℃;
雾化气流速803L/h;反吹气流速45L/h;离子源温度
120℃;毛细管电压2.0kV。苯并咪唑类药物测定参数见
表1 。
1.2.4 SPE 提取与净化方法
1.2.4.1 样品提取
准确称取均质样品5.00~5.50g 于50ml离心管中,加
入20ml 乙酸乙酯- 氨水(98:2,V/V),窝旋振荡1min,
超声波提取30min,4000r/min 离心5min,上清液倒入梨
型瓶中,重复提取一次,合并上清液,40℃旋转蒸发,
使乙酸乙酯蒸发干,以10ml 正己烷溶解剩余油状物。
1.2.4.2 样品净化
以5ml 甲醇、5ml 正己烷活化SPE 柱。将正己烷溶
液以2ml/min 速度过活化好的SPE 柱,用10ml 正己烷溶
液淋洗,抽干,以2.00ml 甲醇- 甲酸(95:5,V/V)洗脱,
抽干,收集全部洗脱液,加入2ml 水,混匀过膜,上
LC-MS-MS 测定。
1.2.5 GPC 提取与净化方法
1.2.5.1 样品提取
准确称取均质样品5.00~5.50g 于50 ml 离心管中,
加入20ml 乙酸乙酯/ 氨水(98:2,V/V),窝旋振荡1min,
超声波提取30min,4500r/min 高速离心5min,将上清
液倒入50ml 容量瓶,重复提取一次,合并上清液,以
乙酸乙酯准确定容到50.00ml。上凝胶渗透色谱仪净化。
1.2.5.2 凝胶渗透色谱法(GPC)净化
苯并咪唑类药物在GPC上的洗脱规律:将l.0ml配置好
的6种苯并咪唑类药物标准溶液(10.0μg/ml)加入到10.0ml乙
酸乙酯中,混匀,通过凝胶渗透色谱仪净化系统( 进样
量5.00ml),以50% 乙酸乙酯- 环己烷为流动相,流速
为4.7ml/min,从6min 开始,用10ml 试管每隔1min 收
集流出液,在试管中加入1.00ml 水,40℃氮吹蒸干上
层有机相,加入1.00ml 乙腈,混匀过膜,上LC-MSMS
测定,以流出浓度的百分比和时间的关系绘制其流
出曲线图。
鳗鱼样品的洗脱规律:分别取试剂空白( 乙酸乙
酯) 、样品空白( 阴性鳗鱼样品的提取液)、苯并咪唑类
药物标准品(1.0μg/ml,乙酸乙酯稀释得到)、加标样品
提取液(加标量1.0μg/ml) 上GPC 进行洗脱,用GPC 自
带紫外检测器以236nm 波长进行扫描,可以得到其紫外
监测图。
鳗鱼样品的净化:取10ml 鳗鱼样品提取液上GPC
进行自动洗脱(GPC 进样量为5.00ml),收集10~30min
洗脱液进行自动浓缩,2.0ml 乙腈定容。从乙腈溶液中
取0.50ml,加入0.50ml 水,混匀过膜,上LC-MS-MS
测定。
化合物母离子子离子驻留时间锥孔电压碰撞
名称质量数质量数(s) (V) 能量(V)
MEB 296.00
264.10* 35.0 20.0
105.10
0.1
35.0 35.0
ALB 266.00
234.10* 40.0 20.0
191.10
0.1
40.0 30.0
OXI 250.10
218.10* 35.0 18.0
176.10
0.1
35.0 27.0
OXF 316.10
159.10* 37.0 30.0
191.10
0.1
37.0 20.0
FLU 314.00
282.10* 35.0 21.0
123.10
0.1
35.0 35.0
FEN 300.10
268.10* 33.0 20.0
159.10
0.1
33.0 35.0
表1 6 种苯并咪唑的质谱检测条件
Table 1 MS condition of detection of six benzimidazole
anthelmint ics
注:* . 定量子离子。
OR
※分析检测食品科学2009, Vol. 30, No. 08 179
2 结果与分析
2.1 线性关系与检出限
配置不同浓度范围的苯并咪唑类药物标准品,浓度
范围0.5~10.0ng/ml,以浓度(ng/ml)为X,峰面积为Y,
将实验数据进行一元线性回归处理,获得内标定量校正
曲线为:MEB:Y=30615.0X+533.518(r=0.9998);ALB:
Y= 25164.8X - 688.934(r = 0.9994);OXI:Y=33482.3
X+553.208(r=0.9996);FLU:Y=16996.9X+666.791(r =
0.9978);OXF:Y=11870.2X- 398.84(r = 0.9994);FEN:
Y= 25748.3X - 1759.13 (r = 0.9989); 方法的检测低限为
2.0μg/kg。图1 为六种标准品的质量色谱图。
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
4.67
ALB
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
4.94
FEN
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
FLU 4.34
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
4.18
MEB
图2 六种苯并咪唑类药物在GPC 上的流出时间图
Fig.2 Elution curves of six benzimidazoles anthelmintics on GPC
50
45
40
35
30
25
20
15
10
50
MEB
ALB
OXI
OXF
FEN
FLU
ASOX
流出浓度(%)
时间(min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
3.58
OXF
0.55
图1 多离子反应监测模式下6 种苯并咪唑药物(0.5ng/ml)质量色谱图
Fig.1 Mass chromatograms of six benzimidazole anthelmintics
(0.5 ng/ml) by multiple reaction monitoring mode
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
4.22
OXI
2.2 不同SPE 柱的选择
本实验采用了两种不同的氨基SPE 小柱,Agilent
Amino(NH2) SPE 柱和 CHROMABOND NH2 SPE 柱。两
种SPE 柱都可得到较好的净化效果,但Agilent Amino
(NH2) SPE 柱的批间重现性更好。在阴性鳗鱼样品中添
加4.0μg/kg 甲苯咪唑的回收实验(n=8),采用Agilent
Amino(NH2)SPE 柱净化实验的回收率为81.18%,精密度
4.55%,采用CHROMABOND NH2 SPE 柱净化实验的回
收率为79.32%,精密度为8.43%。因而采用Agi lent
2.3 GPC净化效果
OR
OR
400
350
300
250
200
150
100
50
0
2
紫外吸收强度
时间(min)
0 5 10 15 20 25 30
60
50
40
30
20
10
0
-10
1
紫外吸收强度
时间(min)
0 5 10 15 20 25 30
2009, 180 Vol. 30, No. 08 食品科学※分析检测
本实验采用Bio-Beads S-X3GPC 色谱柱填料,其介
质是中性、多孔的聚苯乙烯二乙烯基苯微球体,用于
亲脂性多聚物和有机洗脱溶质的分子量排阻层析。从六
种苯并咪唑类药物在GPC上的流出时间图(图2)可以看出
苯并咪唑类药物在GPC 上的流出时间主要集中在10~
25min 之间。而从GPC 紫外扫描图(图3)中可以看出,鳗
鱼样品中干扰基质(主要为油脂)的流出时间在5~15min
之间。本实验截取10~25min 之间流出物,可以除去大
部分的脂类化合物。图4 为经过GPC 净化后的加标样品
质量色谱图。从图4 中可以看到质量色谱峰附近基本没
有干扰,样品得到了较好的净化。
2.4 空白与加标回收实验
125
100
75
50
25
0
3
紫外吸收强度
时间(min)
0 5 10 15 20 25 30
1 . 试剂空白;2 . 样品空白;3 . 标准品;4 . 加标样品。
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
4
紫外吸收强度
时间(min)
0 5 10 15 20 25 30
图3 GPC 紫外扫描图(236nm)
Fig.3 Chromatograms of blank, mixed standards and eel sample
added with mixed standards or not on GPC (detected at 236 nm)
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
ALB 4.44
100
50
0
信号强度(%)
4.69
时间(min)
FEN
2.82
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
100
50
0 信



(%)
时间(min)
3.97
2.81 2.88
2.99
MEB
3.52
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
OXF
3.29
0.53 1.69 2.35 4.70
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
图4 GPC 净化加标鳗鱼样品(2.0 μg/kg)质量色谱图
Fig.4 Mass chromatograms of spiked eel sample (2.0 μg/kg)
purified by GPC
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
OXI 3.97
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
添加水平(μg/kg)
方法化合物 2.0 4.0 8.0
RECV(%) RSD(%) RECV(%) RSD(%) RECV(%) RSD(%)
MEB 96.58 11.82 80.18 4.55 97.25 4.80
ALB 73.42 3.32 74.57 10.18 90.40 6.02
SPE
OXI 78.17 7.94 73.04 6.76 97.88 5.23
OXF 77.58 10.41 72.11 5.28 108.75 2.43
FLU 78.67 10.09 79.54 7.90 96.63 6.12
FEN 70.92 7.96 76.25 8.04 83.63 3.32
MEB 78.92 10.27 75.13 8.13 74.08 9.60
ALB 74.96 13.54 80.54 9.44 88.44 12.10
GPC
OXI 74.96 9.99 84.02 10.58 86.78 13.54
OXF 70.46 12.54 73.02 6.49 88.89 10.63
FLU 73.54 12.55 83.54 7.42 81.66 10.73
FEN 79.88 8.71 72.00 8.39 75.46 13.69
表2 鳗鱼肌体中6 种苯并咪唑的添加回收率和精密度(n=8)
Table 2 Spike recoveries and determination accuracies (%,
n=8) of benzimidazole anthelmintice in eel sample
100
50
0
信号强度(%)
时间(min)
FLU
4.11
2.36 2.75
0.5 1.5 2.5 3.5 4.5
2.59
※分析检测食品科学2009, Vol. 30, No. 08 181
分别取5.0g 阴性鳗鱼样品,加入0.1μg/ml 苯并咪
唑类药物标准品溶液0、0.1、0.2、0.5ml (添加水平为
0、2.0、4.0、8.0μg/kg),分别采用SPE 法和GPC 法
对样品进行前处理。表2 为两种前处理方法得到的添加
回收率和精密度。
从表2 结果总体上看,SPE 方法和GPC 方法对6 种
苯并咪唑类药物在2.0μg/kg 添加水平上的回收都大于
70%,小于110%,RSD 值都小于15%,符合残留检测
的要求。
3 结 论
本方法采用固相萃取法(SPE)凝胶渗透色谱法(GPC)对
鳗鱼样品进行净化,采用液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)
检测。结果表明两种方法都符合残留检测的要求,
检测低限可以达到2.0μg/kg。SPE 方法前处理较为复杂,
但其可以同时处理多个样品,适用于批量检测;GPC 方
法操作简单,前处理过程自动化程度高,省人工,其
平均处理一个样品只需要35min,但因为无法同时处理
多个样品,只适合少量样品的快速检测。
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