PRM+DIA：蛋白质组学大数据筛选+精准验证

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蛋白大数据筛选+精准验证：DIA技术给您找到目标蛋白，PRM技术助你快速精确验证；

DIA+PRM技术一站式服务: 让你的实验结果无可挑剔，为您的研究发表提供精确快速的通道

随着质谱仪器的不断更新换代，蛋白组学的技术也不断的革新，从最早的2-D电泳技术到基于LC-MSMS的蛋白定性；从Labelfree 技术到 标记定量iTRAQ/TMT技术以及时下备受推崇的DIA/SWATH技术、PRM/MRM技术，每一次的技术革新都使得蛋白组学研究更上一阶。 

DIA+PRM技术，全蛋白组筛选及目标蛋白验证一体化  

当下蛋白组学研究中应用较广泛的技术是同位素标记定量（iTRAQ/TMT技术）。 iTRAQ/TMT技术利用的用DDA扫描模式，其扫描的方式是将一级质谱信号非常强的Top 20的多肽进行二级打碎，然后进入二级质谱进行检测。其优势是二级谱图采集的肽段信息都来源于同一条多肽，有利于后续的定性分析，但这种采集方式会忽略一些肽段的信息；而且对于大样本量的组学实验，iTRAQ/TMT技术也存在一定的通量限制。那么有没有一种技术可以解决目前蛋白组学困局呢？
对于组学数据的验证，常规的方法有：PCR、RT-PCR、WB技术、Elisa技术等，但是对于蛋白组学的验证，RNA水平的验证显然不能满足科研工作者的要求；WB技术和Elisa技术虽然在某种程度上解决了不同组学之间的尴尬，但是由于抗体的定制难度，在非模式物种中的应用一直无法进行。在这样的一个基础上，DIA、PRM技术隆重登场... DIA+PRM技术可以解决目前蛋白组学中存在的这些问题。

1.DIA技术原理：                                          

图1 | DIA技术流程

DIA技术是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库，之后采用DIA方法进行质谱数据采集，从而实现对样品中蛋白质的定性及定量，不同于传统的DDA技术，DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。

2.DIA优势

DDA模式对肽段离子的选择具有限制性和随机性，存在较多的数据信息缺失，而DIA模式的目标则是获得完整的数据，实现蛋白质的深度覆盖和精准定量。此外在复杂样品中，二级信号的定量比一级信号更为灵敏（例如一级质谱信号可能存在相似质荷比离子的干扰）。DDA模式为一级质谱信号定量，而DIA模式为二级质谱信号定量，因此DIA模式的定量准确性和重现性都更好。
DDA模式下肽段分子和其二级碎片离子有着对应关系，通过对已知数据库的搜索匹配，即可得到样本中的肽段及相关蛋白质信息。而DIA模式下肽段离子与其碎片离子之间的直接关系丢失（DIA光谱中的碎片离子可能是由多个肽段离子），复杂的谱图仍然给后续的数据分析和统计学检验带来很多挑战。对此目前已有多个团队开发出DIA分析的软件，例如OpenSWATH和Skyline，这些软件通过建立样本的参考库，对色谱峰进行抽提并分析。此外也有研发团队提出不需要参考库的数据分析方法DIA-Umpire，通过对肽段离子和碎片离子的匹配合成产生虚拟谱图进而搜库分析。因此，DIA技术非常适合一次性获取数百上千种蛋白质更为全面信息（高覆盖率，高准确度，高重复性）的研究；而且检测的数据可永久保存，方便后续做回溯性分析。
表1. DIA和DDA技术对比

3.PRM技术原理

PRM：平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量，因此也被称之为基于液相色谱质谱联用技术的Western Blot（LC-MSMS based Western Blot, L-WB）。PRM技术基于Q-Orbitrap为代表的高分辨、高精度质谱平台（MRM技术基于SCIEX QQQ 系列质谱，以SCIEX-6500为代表），首先利用四级杆质量分析器的选择能力，用Q1选择目标肽段的母离子，随后在Collision cell 中对母离子进行碎裂， 最后利用Orbitrap分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

图2 | PRM靶向定量蛋白质组学分析基本流程

4.PRM优势

PRM作为蛋白质组学靶向质谱检测方法，无需抗体，其通过Q-Orbitrap系列质谱仪，以四极杆作为质量过滤器，特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子（母离子）通过，可以有效排除干扰离子，有着高度特异性。其基于二级碎片离子定量，定量准确度高。与传统MRM技术相比，更高分辨、更高质量精度的Orbitrap分析器使得其有着更高的灵敏度，且其对二级离子全扫描，无需预设子离子，方法学建立简便，结果更为准确。以DDA结果建立的PRM参考库，使得PRM不仅具有靶向定量分析能力，同时还具备定性能力。在确保数据质量的前提下，为了在一次分析中检测更多的蛋白质，可用预置PRM（Scheduled PRM, sPRM）的方法，这种方法需要知道每个肽段的保留时间信息，使得每个肽段只在其洗脱时间窗口内执行PRM检测，大大提高了检测效率，通量高，可同时检测几十种蛋白质。其技术优势使得PRM技术可区分高度相似蛋白，包括验证蛋白质翻译后修饰、突变、蛋白亚型等序列高度相似蛋白。
表2. PRM技术优势

PRM和DIA各自都有这么多优势，那将这2个前沿的技术合起来使用会是什么样的效果呢？显而易见，合起来使用，你不仅可以享受到给各自的优势，还具备PRM验证可使用DIA的数据库资源，也就是说不用重复建库，一个数据库就搞定（PS：省了一笔重复建库费用）；另外，PRM验证让您不再忧愁各种途径找定制化抗体。

那么DIA+PRM技术能够适用哪些研究呢？答案是各领域均适用，尤其是针对临床医学样本，更是强力推荐。

5.DIA+PRM应用范围

图3 DIA+PRM技术适用于各个研究领域

DIA+PRM线上讲座

地点：线上讲座
主讲人：徐燕
主讲人简介：上海交通大学系统生物医学研究院毕业，研究方向疾病蛋白质组学，学位论文为脓毒症血浆外泌体的分离提纯及其蛋白质组研究，并以第一作者在Biochemical and biophysical research communications上发表SCI论文。

讲座简介：1、蛋白组学技术概括 2、DIA技术+PRM技术简介 3、技术研究思路及文献挖掘   4、DIA、PRM技术研究流程    5、投稿推荐等干货内容

下面让我们一起来看一个DIA+PRM的文献实例

蛋白质组学DIA+PRM技术研究研究Pro-B淋巴细胞Ebf1杂合性


Early B cell factor 1（EBF1）是协调B细胞谱系发育所需的关键转录因子之一。尽管研究表明Ebf1单倍剂量不足（haploinsufficiency）参与白血病的发展，但尚未表征Ebf1杂合性对pro-B淋巴细胞蛋白质组的全局影响。来自德国弗莱堡马克斯普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所Gerhard Mittler团队，通过DDA（data dependent acquisition）和DIA（data independent acquisition）质谱技术鉴定Ebf1^+/+ and Ebf1^+/-细胞系间的差异表达蛋白，发现DIA鉴定结果无论是蛋白鉴定数目还是得到的差异蛋白数目，均要优于DDA鉴定结果。

图4. 比较DDA和DIA方法鉴定到的肽段、蛋白质和差异蛋白数量

接着该团队选择了5种差异蛋白（EBF1, Pax5, TCF3, BCL2 and TNPO3）进行PRM（Parallel Reaction Monitoring）验证，验证结果与DIA结果相吻合。结果表明与EBF1相似，其他B细胞谱系调节因子（例如TCF3和Pax5）的表达也在Ebf1杂合细胞中下调。此外DIA差异表达蛋白的功能性分析显示，EBF1杂合性导致至少八种参与淋巴细胞生成的转录因子的失调，并且导致在pro-B淋巴细胞的存活、发育和分化中起作用的关键蛋白的失调。

图5. 候选蛋白的PRM相对定量验证结果

参考文献
Musa YR et al. Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-B Lymphocytes Utilizing Data Independent Acquisition. J Proteome Res. 2018 Jan 5;17(1):76-85.

相信通过这样的一篇研究文献您能够更加了解DIA+PRM技术的优势，若您想阅读更详细的文献，请点此链接观看原文http://www.lumingbio.com/site/downloadCenter/13

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