多家机构联合、多种蛋白组学联合发现 ALS患者组织3个前途潜在生物标志物

发布时间： 2020-04-15 02:16 来源：上海鹿明生物科技有限公司

2019年11月，德国乌尔姆大医院神经内科联合几家机构在一区期刊Acta Neuropathologica （IF=18.174）发表题为“Proteomics in cerebrospinal fluid and spinal cord suggests UCHL1, MAP2 and GPNMB as biomarkers and underpins importance of transcriptional pathways in amyotrophic lateral sclerosis”的文章。利用iTRAQ+PRM+Label free的蛋白质组学技术，寻找到了3个很有前途的潜在ALS生物标志物，可能为患者的早期诊断和疾病进展过程的评估提供帮助。

样本：脑脊液+脊髓组织

仪器：Q Exactive（Thermo Scientific）、QTRAP 6500（AB Sciex）

软件：MaxQuant、Skyline

发表期刊：Acta Neuropathologica

影响因子：18.174

技术手段：iTRAQ+PRM+Label free蛋白质组学

研究背景

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种罕见且致命的神经退行性疾病，其特征是严重的运动神经元丧失，最后在3-5年内死于呼吸衰竭。目前ALS的诊断以临床症状为基础，妨碍了对患者症状前期的研究，不利于患者尽早诊疗。且只有5%的ALS患者有明确的单基因背景，散发ALS（sALS）的病因仍不清楚。而目前最有希望的ALS生物标记候选物是脑脊液（CSF）和血液中的神经丝，但它出现在有症状的疾病阶段，且在疾病进程中浓度水平不会改变。因此，迫切需要寻找新的ALS相关通路，弥补目前对ALS在病理生理学认识上的空白，为疾病治疗策略的改进提供新的靶点，并为早期诊断和疾病进展过程建立新的候选生物标记物，进一步帮助药物开发。

研究思路

实验结果

一.脑脊液标本的蛋白质组学比较

为了在无症状ALS突变携带者和有症状的gALS和sALS中识别新的疾病途径和分析蛋白质改变水平，使用iTRAQ标记定量蛋白质组对对照组Con（n=16）、无症状ALS突变携带者Car（n=14）和sALS（n=12）和gALS（n=14）患者的脑脊液样本进行比较（临床资料见表1）。排除血液污染的样本（2个Con，1个Car，2个sALS，3个gALS），最终有1929个蛋白用于蛋白定量分析。

表1 |脑脊液发现阶段（iTRAQ）和验证阶段（MRM）队列的临床资料

ALS：肌萎缩侧索硬化症，ALSFRS-ra：ALS功能评分修订值，Con：对照组，f：女性，gALS：遗传性ALS，LP lumbar puncure：腰椎穿刺，m：男性，sALS：散发性ALS

a 中位数和四分位数范围

b 卡方检验（性别）、Mann-Whitney检验（两组）或Kruskal-Wallis检验和Dunn's事后检验（两组以上）。

将有症状的ALS患者（sALS+gALS）与对照组（Con）进行比较，筛选到32个显著差异蛋白（FDR=0.05）（表2）。

表2 |ALS患者脑脊液中的显著差异蛋白（FDR=0.05）

在ALS（（sALS+gALS））中，已建立的ALS标记NEFL、NEFH和CHIT1显著上调，而另一个神经退行性的生物标记物tau蛋白则没有改变，此结果与先前的研究相符，这表明我们的蛋白质组学能够很好的识别CSF样本与疾病相关的低丰度蛋白质。ALS患者（sALS+gALS）显著下调的3种蛋白质，均为组蛋白家族，另外显著上调的蛋白质有NEFL、NEFH 、NEFM、 CHIT1 、GPNMB、CHI3L1、CHI3L2、APOC2、APOC3（FDR<0.05）（图1a）。GO富集分析显示，显著差异蛋白为神经丝、核小体、中/高密度脂蛋白重塑、RNA聚合酶等与转录、核小体、细胞周期、脂质蛋白重塑途径相关的蛋白质（图1b）。

图1 | iTRAQ标记定量蛋白组学揭示ALS患者脑脊液中的蛋白质差异效果

（a）比较ALS（sALS+gALS，n=22）和年龄及性别匹配的对照组（Con，n=14）脑脊液蛋白质表达水平的火山图;

（b）ALS CSF中显著差异蛋白的GO富集分析;

（C）ALS患者32个显著差异蛋白的聚类分析；

二.应用PRM验证ALS（sALS + gALS）候选生物标志物

作者采用PRM分析靶标蛋白（NEFM、GPNMB、MAP2、SERPINA3、UCHL1、CAPG和GBA）的生物标志物潜能。与对照组相比，确认了ALS（sALS+gALS）患者的脑脊液中NEFM、GPNMB、MAP2、UCHL1和CAPG含量显著上调，SERPINA3和GBA在两组间无显著性差异（图2）。发病年龄与GPNMB（r=0.52，p<0.001）、MAP2（r=0.30，p=0.04）、UCHL1（r=0.61，<0.001）和CAPG（r=0.40，p<0.001）显著相关，而与NEFM无关（r=0.28，p=0.05）。发病到腰椎穿刺的时长与GPNMB（r=-0.37，p<0.001）和MAP2（r=-0.30，p=0.04）呈显著负相关，但与其他蛋白质（UCHL1:r=-0.20，p=0.06，CAPG:r=0.01，p=0.95，NEFM:r=0.12，p=0.39）无显著相关。ALSFRS-r评分与GPNMB（r=-0.44，p<0.001），UCHL1（r=-0.25，p=0.02）和CAPG（r=-0.30，p=0.005）显著相关，但不包括MAP2（r=-0.22，p=0.13）和NEFM（r=0.01，p=0.97）。

图2 | 候选生物标志物的PRM分析

为了评估生物标志物的预后价值，我们进行了患者的生存时间分析。GPNMB与生存时间呈显著负相关，但UCHL1、CAPG、MAP2和NEFM则无显著相关性（图3a）。脑脊液中GPNMB水平高于中位数的ALS患者的生存时间明显短于低GPNMB水平的患者（图3b、3c）。

图3 |ALS患者CSF-GPNMB水平升高与生存期缩短有关

（a）验证队列（n=46）中一部分gALS和sALS患者的CSF-GPNMB蛋白质含量与从LP到死亡时间的相关分析（Spearman）。CSF-GPNMB蛋白质含量低于或高于中位浓度的ALS患者的（b）Kaplan-Meier曲线和（c）箱型图显示，GPNMB水平高的ALS患者生存期较短。

（b）log-rank检验，p=0.006；

（c）Mann-Whitney检验，**p=0.002。

三.无症状ALS突变携带者与对照者的蛋白质组比较

将无症状ALS突变携带者的CSF蛋白质组与对照组进行比较，两组之间的无显著差异（FDR<0.05，图4）。

图4 | 无症状ALS突变携带者脑脊液蛋白质组无显著变化

为了确定在疾病发生前可能逐渐改变的蛋白质，我们将无症状ALS突变携带者的蛋白质水平与疾病发生的预期时间进行关联分析，发现16种蛋白质与预期发病时间呈显著相关（Spearman r>0.5或<-0.5和p<0.05）（表3）。

表3 |无症状ALS突变携带者中与预期发病时间显著相关蛋白

AD：阿尔茨海默病；

ALS：肌萎缩侧索硬化；

MS：多发性硬化症；

FTLD：多发性硬化症；

PD：帕金森病；

SCA：小脑萎缩症；95%CI：95%置信区间。

四.死者脊髓组织蛋白质组分析

使用Label-free蛋白质组学技术对ALS（n=8）和对照组（n=7）的死者脊髓组织进行比较。排除血液污染样本及一些不合格数据后，确定了5115个蛋白质，ALS中公有292个蛋白质发生显著变化（139个下调，153个上调，FDR=0.05），包括ALS相关蛋白，如APOE、hnRNPA2b1、LMNB1、NEFH、NEFL、NEFM、PRPH、SARM1和SOD2。

图5 | Label free蛋白质组学技术揭示脊髓组织中的蛋白质差异

（a）比较ALS（sALS+gALS，n=8）和对照组（Con，n=7）死后脊髓组织蛋白质表达水平的火山图。

（b）292个显著差异蛋白质的聚类分析。

表4列出了前30种显著差异蛋白，其中参与mRNA剪接、催化步骤2剪接体和神经丝的蛋白质在变化的蛋白质组中显著富集。基于292个差异调节蛋白，分级聚类确定了两个主要的聚类（图5b）。聚类1包含7个对照组中的6个（86%），聚类2包含所有ALS患者（100%）。

表4 |ALS（sALS+gALS）患者死后脊髓组织中差异变化前30位的蛋白

五.联合分析脑脊液与脊髓组织蛋白质组学数据

据联合分析结果，可将脑脊液和脊髓组织中的1049个蛋白分为四组：（1）脊髓组织中表达下调，脑脊液中表达上调；（2）两者均表达上调；（3）脊髓组织中表达上调，脑脊液中表达下调；（4）两者均下调。其中，组（2）富含与补体和凝血级联和ECM受体相互作用有关的蛋白质，组（3）富含核小体和核小体的蛋白质。组（1）有神经丝和其他细胞骨架蛋白，但组（1）和组（4）没有显著富集。

图6 | 脑脊液和脊髓组织蛋白质组数据的联合分析

蛋白分为四类：

（1）在脊髓组织中下调和脑脊液上调，包括神经丝蛋白（蓝色）；

（2）两者均上调（红色）；

（3）脊髓组织中上调和脑脊液下调（绿色）和（4）两者均下调（粉色）。

实验结论

通过利用iTRAQ、PRM和Label free三种蛋白质组学技术对ALS患者脑脊液和脊髓样本蛋白组数据进行研究，发现UCHL1、MAP2和GPNMB有潜力作为ALS新的生物标志物。同时，无症状ALS突变携带者脑脊液中缺乏显著的蛋白质组变化支持了ALS临床前阶段较短的事实。

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文章利用蛋白质组学手段研究鉴定ALS的潜在生物标志物簇。首先利用iTRAQ标记定量蛋白质组学技术检测发现队列脑脊液中蛋白质，筛选出显著差异蛋白。再利用PRM靶向蛋白质组学技术验证发现队列脑脊液中的显著差异蛋白，同时利用Label free非标记定量蛋白质组学技术检测脊髓组织中显著差异蛋白。最后作者将脑脊液和脊髓组织样本中的显著差异蛋白进行联合分析，发现了3个非常有价值的潜在ALS鉴定生物标志物簇。本文联合利用iTRAQ、PRM和Label free三种蛋白质组学手段去分别分析两种样本（脑脊液和脊髓组织）中的差异蛋白，十分值得借鉴。

文末看点

运用多种技术联合研究的科研案例在不断地刷新着投稿期刊的高度，特别是在疾病的早期诊断和疾病进展评估中。鹿明生物自2017年初建立了蛋白组学技术平台（iTRAQ/TMT、DIA、PCT-DIA、PRM、修饰蛋白组），是国内早期开展多种联合分析蛋白组学研究机构，目前鹿明生物也推出了蛋白组学检测+验证一体化--1+1>2的蛋白组学黄金组合服务:DIA +PRM技术，满24个样本，为您立即省18000¥。详情请戳【活动】新一代质谱检测DIA技术 ×WB替代技术的强力联合

参考文献

Patrick Oeckl, Patrick Weydt, Dietmar R. Thal et al. Proteomics in cerebrospinal fluid and spinal cord suggests UCHL1, MAP2 and GPNMB as biomarkers and underpins importance of transcriptional pathways in amyotrophic lateral sclerosis [J]. Acta Neuropathologica,2020，139(1):119-134.

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