2020开门篇! Plant cell (IF:8.6)​浙大、川大研究者通过影响水稻磷酸盐转运蛋白的转运来调节磷酸盐的稳态

前言

磷是植物生长和繁殖所必需的矿物质营养元素之一，磷酸盐(Pi)是植物能吸收磷形态的主要形式。 影响植物对Pi吸收的主要途径是细胞膜(PM)定位Pi的转运蛋白(PTs)。蛋白磷酸化是两种拮抗酶催化的可逆反应:蛋白激酶和蛋白磷酸酶。尽管在水稻中，随着Pi水平的升高，PTs被CK2磷酸化，但目前尚不清楚PTs在植物中是如何去磷酸化的。本篇为2020年1月9号，由浙江大学生科院植物生理生化国家重点实验室zhili yang和四川大学生科院生物资源与生态环境教育部重点实验室jian yang为第一作者共同发表在《Plant Cell》上文章。该文章报道了可逆的PTs磷酸化机制的确定，为植物适应可变的Pi环境提供依据，有助于高效作物的遗传改良。
 

中文标题：蛋白磷酸酶95通过影响水稻磷酸盐转运蛋白的转运来调节磷酸盐的稳态

材料：日本粳稻

影响因子：8.631

发表期刊：Plant cell

研究背景
 

植物对磷的吸收依赖于质膜定位的转运蛋白。OsCK2使水稻(Oryza sativa)中的PTs磷酸化并抑制其从内质网(ER)向PM的转运，但PTs如何去磷酸化的机制尚不清楚。本篇文章作者报道了2c型(PP2C)蛋白磷酸酶OsPP95与OsPT2和OsPT8相互作用，并使OsPT8在Ser-517位点去磷酸化。过表达OsPP95的水稻植株降低了OsPT8的磷酸化，促进了OsPT2和OsPT8从ER向PM的转运，导致Pi的积累。为植物适应可变的Pi环境提供了依据。

研究结果
 

1.OsPP95与PTs的相互作用

为了探究蛋白磷酸酶是否调控PTs的去磷酸化及影响ER出口和转运到PM，作者研究了GFP（绿色荧光蛋白）标记的OsPT2和OsPT8在使用和不使用普通蛋白磷酸酶抑制剂（cocktail II；Sigma-Aldrich）处理后的亚细胞定位。研究结果表明，从ER到PM蛋白磷酸酶是PTs磷酸化运输所必需的。

为了缩小潜在候选PP2Cs的范围，作者从90个PP2C家族基因中筛选出31个候选分子通过酵母双杂交（Y2H）试验与OsPT8相互作用。在Y2H实验中，OsPP95与OsPT8和OsPT2相互作用(图1A和1B)。为了识别OsPP95与PT相互作用的结构域，将OsPP95蛋白分为OsPP95NT和OsPP95CT（图1A）。OsPT2和OsPT8与OsPP95的n端而非c端相互作用(图1B)。进一步利用水稻原生质体瞬时表达OsPP95-NT-FLAG与GFP或OsPT8-GFP的co-IP检测证实OsPP95-NT-FLAG可被OsPT8-GFP融合蛋白共免疫沉淀，而不能与GFP对照共免疫沉淀(图1C)。推测出OsPP95也与OsPT8的c端相互作用(OsPT8- ct)(图1D)。
 

图1 |水稻PP95与磷转运蛋白（PTs）发生的相互作用

为了测试这种相互作用，作者使用瞬时表达OsPP95-FLAG的烟叶与GFP或OsPT8-CT-GFP进行co-IP测定。OsPP95-FLAG在OsPT8CT-GFP免疫沉淀蛋白中检测到，而在GFP对照中未检测到(图1E)。进一步的GST实验证实OsPT8CT在体外与OsPP95相互作用(图1F)，提示OsPP95与OsPT8的c端相互作用。这些结果提示OsPP95在调节PP2C蛋白之间的PTs中起着特殊的作用。

为了验证OsPP95和PTs之间的相互作用，并研究它们在植物中相互作用的亚细胞位置，作者进行了双分子荧光互补实验，结果证明了OsPP95在体内和体外与PTs相互作用(图1G)。

2.OsPP95在根和芽中表达，其蛋白定位于所有亚细胞间室

研究表明OsPP95在根、茎和叶中表达(图2C-2I)。在根中，GUS活性在根的初级表皮、外皮层、木质部、侧根的皮层和中柱都有检测(图2C-2F)。在叶片中，除了球状细胞外，所有细胞类型均可见GUS染色(图2G)。茎部血管组织中检测到GUS染色(图2H)。OsPP95在运输维管束和弥散维管束中表达，而在扩大维管束中不表达(图2I)。
 

图2 | PP95的亚细胞定位和组织特异性表达

3.OsPP95调节Pi 的稳态

为了研究OsPP95在水稻Pi稳态调节中的作用，作者对野生型水稻构建了OsPP95表达转基因系。选择3个具有独立代表性的过表达系(OsPP95-OV3、OsPP95-OV7和OsPP95-OV12)进行进一步分析(图3A)。在pi充足的条件下，OsPP95过表达植株的茎和根均小于野生型植株(图3B和3D)。OsPP95-OV植株老叶叶尖坏死，是水稻典型的Pi中毒症状(图3C)。此外，在Pi充足的条件下，OsPP95-OV植株的Pi浓度约是根中的1.6倍，是芽中的1.8倍(图3E)。然而，在缺乏pi的条件下，OsPP95-OV植株的茎和根的生长都与野生型植株相当，尽管其中两个过表达系的根鲜重低于野生型植株(图3B和3D)。在缺乏Pi的条件下，OsPP95-OV老叶片未见叶尖坏死(图3C)，OsPP95-OV芽的Pi水平是野生型植株芽的0.5倍(图3E)。此外，OsPP95-OV叶片中Pi水平均高于Pi充足和缺乏条件下的野生型植株叶片(补充图5)。
 

图3 | PP95的过表达导致水稻Pi积累

为了进一步研究OsPP95在水稻中的生理功能，作者进行测序分析。结果表明：pp95突变体在pi充足和缺乏条件下的生长与野生型植株相似(图4A和4B)。在Pi充足的条件下，pp95的上部和根中的Pi浓度与野生型无显著差异(图4C)。然而，在缺乏Pi的情况下，pp95根的Pi水平比野生型下降了30%，而在不同品系间，幼苗的Pi水平没有显著差异(图4C)。作者检测了OsPP95突变是否影响pp95叶片中Pi的分布，结果表明，OsPP95参与了不同Pi条件下水稻Pi的稳态和分布调节。
 

图4 | PP95突变改变水稻Pi内环境平衡

4.OsPP95与CK2拮抗调节Pi的稳态

由于OsCK2和OsPP95与PTs的c -端相互作用，作者推测OsPP95可能与OsCK2发生拮抗作用。通过基因测序。结果表明，OsPP95的过度表达逆转了OsCK2α3的过度表达（图5）。

由于OsPP95的突变会影响Pi在不同叶片间的分布，作者认为OsCK2可能也会调节Pi的分布。为了验证这个假设,作者分析了α3-Ri和b3-Ri植物在Pi充足和不足条件下不同叶片的Pi水平。研究结果表明，OsPP95与OsCK2呈拮抗作用，调节水稻不同叶片间的Pi分布。

图5 | 水稻CK2与PP95的遗传互作

5.OsPP95直接脱磷PTs

为了确定OsPP95是否具有磷酸酶活性，作者使用显色底物对磷酸盐(pNPP)进行了体外磷酸酶测定。从大肠杆菌细胞中纯化的GST-OsPP95在不同金属离子的溶液中进行了活性测试。GST-OsPP95在Mn²⁺存在时具有磷酸酶活性(图6A)。然而，在所有检测的溶液中，高度保守的金属结合位点(Asp)突变为非活性形式(Asn)的GST-OsPP95D240N都丧失了其磷酸酶活性(图6A)。这些结果表明，OsPP95是一种Mn²⁺依赖性蛋白磷酸酶。
 

图6 | PP95直接脱磷PTs

因为OsPP95在ER直接与PTs相互作用，起着蛋白磷酸酶的作用。作者推断OsPP95可以直接使PTs去磷酸化。为了验证这个假设,作者使用了抗体检测磷酸化的OsPT8 OsPP95-OV12 ER和α3-OV(图6 b)。检测到了两个条带，包括磷酸化和非磷酸化的OsPT8(图6B)。发现从ER提取物检测到更多磷酸化的OsPT8，但在OsPP95-OV提取物中检测到的差异显著减少。此外,在α3-OV/OsPP95-OV双过表达系中检测到的磷酸化OsPT8少于在α3-OV中检测到的磷酸化OsPT8(图6 b)。这些发现支持了OsPP95在OsPT8去磷酸化中起到关键作用。

 作者在2015年报道过OsPT8的C末端的Ser-517被OsCK2α3磷酸化。因此，作者在体外磷酸化实验中，以OsPT8 (OsPT8CT)的c端为底物，检测OsPP95是否参与了OsPT8在Ser-517位点的去磷酸化。OsPT8CT被OsCK2α3磷酸化(图6 c),这是与以前的结果一致。然而，在使用OsPP95处理的样品中，PT8CT磷酸化水平显著下降，而突变版本OsPP95D240N则没有下降(图6C)，这表明OsPP95在Ser-517位点去磷酸化OsPT8。

6.OsPP95与CK2拮抗，调节PTs的ER出口

由于OsPP95与CK2拮抗，调节OsPT8在Ser-517位点的磷酸化状态，作者推测OsPP95可能调节了PTs的ER出口。为了验证这种可能性，我们测量了OsPP95-OV系和pp95突变体的ER和PM中的PT8蛋白水平。同时作者检查了的亚细胞定位水稻原生质体超表达结构。为了进一步证实这个结果,作者对过度表达的转基因植物研究。结果表明，OsPP95通过拮抗CK2，在调节PTs的ER出口中发挥重要作用（图7）。
 

图7 | PP95与CK2拮抗作用，调节PTR的ER释放

7.与pi充足条件下相比，pi缺乏条件下OsPP95更稳定

通过定量逆转录PCR (quantitative reverse-transcription PCR, qRT-PCR)测定，这些结果表明，在缺乏pi的情况下，OsPP95更稳定。免疫印迹分析显示，表明OsPP95的降解依赖于泛素/26S蛋白酶体途径。总之，这些结果表明Pi饥饿促进了OsPP95的稳定性（图8）。
 

图8 | 与Pi充分条件相比，PP95在缺Pi条件下更稳定

8. OsPP95的降解部分依赖于OsPHO2

探讨已知pi -内稳态相关泛素连接酶OsPHO2、OsNLA1、OsUPS和OsPIE1是水稻中OsPP95降解的原因，作者以OsPP95为诱饵进行Y2H测定。结果表明OsPHO2与OsPP95相互作用，并提示OsPHO2可能降解OsPP95。为了确定OsPHO2是否能降解OsPP95，作者将PP95-GFP植株与pho2杂交，得到PP95-GFP / pho2植株。通过免疫印迹分析及抗泛素抗体检测PP95-GFP和PP95-GFP/pho2植物中泛素结合的OsPP95的水平。发现与PP95-GFP相比，PP95-GFP/pho2中泛素结合的PP95-GFP水平明显降低(图9E)。这些结果表明，OsPHO2通过泛素化介导的降解途径参与了水稻中OsPP95的降解（图9）。
 

图9 | opp95的降解部分依赖于烟草中PP95与PHO2或pho2c719a相互作用的OsPHO2（A）BiFC分析

为了研究pp95与pho2之间的遗传相互作用，作者将pp95-10与pho2杂交产生了pp95 pho2双突变体(图10A和10B)。在Pi充足的条件下，与pho2相比，pp95 pho2植株的茎和根的Pi水平分别降低了17%和35%(图10C)。作者测量了pp95 pho2植物不同叶片的Pi水平。与pp95-10相比，在Pi充足的条件下，pp95-10的Pi水平只在最年轻的叶片中降低(图4D)，而在pp95- pho2植物中，3个最年轻叶片的Pi水平显著降低(图10D)。
 

图10 | 水稻中PHO2与PP95的遗传互作

为了进一步证实OsPHO2对OsPP95的影响，作者评估了OsPT8在pho2植物ER中的磷酸化状态(图10E)。磷酸化的OsPT8在pho2的内质中积累的程度小于野生型，而在pp95 pho2植物的内质中，OsPT8的磷酸化程度高于pho2(图10E)。相应的，OsPT8在pho2植株PM中的积累量高于pp95 pho2，而在ER中的积累量低于pp95 pho2(图10F)。总之，这些结果表明，OsPHO2通过OsPP95部分调节Pi的稳态和分布。

研究结论
 

结论，作者发现了与PI相互作用的蛋白磷酸酶OsPP95，它通过与OsCK2拮抗来调节PTs的磷酸化状态和向PM的转运，从而正向调节Pi的稳态和分布。正如我们的工作模型所总结的(图11)，在pi充足的条件下，OsPP95蛋白被OsPHO2降解，PTs被OsCK2全酶磷酸化。这些过程削弱了OsPHF1与PTs之间的相互作用，增强了PTs的ER保留率，使得PT流向PM吸收Pi的流量减少。在pi缺乏的条件下，OsCK2b3降解，OsPP95和OsPHF1更稳定，OsPHO2被OsmiR399裂解。因此，更多的脱磷PTs在OsPHF1和流量的帮助下从ER中退出到PM中，增强Pi的吸收。
 

图11 | PP95在调节从ER到PM的Pi转运蛋白（PT）转运中作用的工作模型

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蛋白磷酸化是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的可逆翻译后修饰，在蛋白定位、稳定性和活性方面起着关键作用。Pi内稳态涉及多种蛋白激酶。但迄今为止，没有发现蛋白磷酸酶在植物的Pi获取和稳态中起作用。本篇文章，作者鉴定了PP2C蛋白磷酸酶OsPP95，它通过脱磷PTs调节Pi的获取和稳态。这一可逆的PT磷酸化机制的确定，为植物适应可变的Pi环境，有助于Pi高效作物的遗传改良。

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