9大验证，精准靶向代谢组学技术对植物各部分次级代谢产物分析研究

前言

2020年2月24日加拿大研究者Jie chen在《Scientific Reports》发表的题为“Secondary Metabolites Profiled in Cannabis Inflorescences, Leaves, Stem Barks, and Roots for Medicinal Purposes”研究文章。本研究首次尝试全面分析植物各个部分的次生代谢物组。同时，本篇通过报道整体的“随从效应”，应用现代方法从传统用途中重新发现各部分的治疗潜力科学方法论。深入了解生物活性化合物的全面概况，可为临床研究提供重要参考价值。

中文标题：植物花序、叶片、茎皮和根中具有药用价值的次级代谢产物特征分析

样本： 植物花序、叶片、茎皮和根

影响因子：4.011

技术手段：靶向代谢组、LC-ESI-MS、HPLC-UV-MS、GC-MS、GC-FID

研究背景

花序的代谢特征是、萜类化合物和黄酮类物质。据研究然而大量次级代谢物的提取物可能比单独提取的有更好的疗效和更少的副作用。不同浓度的不同的次级代谢产物的组合被认为可增加治疗性，即“随从效应”。一项最新研究表明，全植物提取物在治疗小鼠炎症性疾病方面比纯CBD更有益。另一项临床前研究表明，植物制剂在体外产生抗肿瘤反应方面比单纯四氢酚更有效。植物复杂性决定了其历史用途的深度和广度，包括叶子、茎皮和根的单独应用，而现代研究还没有完全开发出它的治疗潜力。
 

图1 | 萜类、甾醇及黄酮类的合成途径

研究植物的两种前体是：

橄榄酸（OLA），来源于聚酮途径；

二磷酸香叶酯（GPP），来源于质体脱氧木酮糖磷酸/甲基赤藓糖醇磷酸酯（DOXP / MEP途径），并进一步合成酶和转化。

萜类化合物来源于甲羟（MVA）途径或DOXP/MEP途径。

DOXP / MEP途径提供GPP形成单萜类化合物（C10），而MVA途径提供三萜类化合物（C15）和角鲨烯的三磷酸法呢基二磷酸酯（FPP）作为三萜类化合物（C30）和固醇的前体。

植物中的黄酮类化合物以游离糖苷或共轭O-糖苷或C-糖苷的形式存在，主要是黄酮和黄酮醇。

研究思路
 

研究方法
 

1. 样品收集与准备

干花序和三种新鲜叶，茎和根。这些植物在温室里保持六个月的正常生长，并开了两个月的花后进行前处理。
 

图2 | 花序，叶，根，茎皮和根

（a）已在营养阶段保持六个月，并在温室中开始开花两个月；（b）干花序；（c）干叶；（d）新鲜的茎具皮，然后去皮（右上角）；（e）新鲜的根料；

2.研究方法

这项研究的目的是利用植物各个部位的化学特征进行全面的调查研究，作者运用如下分析方法进行全面的分析：

● 液质联用技术（LC-MS）进行分析；

● 液相串联紫外及质谱检测器（LC-UV-MS）进行黄酮类化合物分析；

● 气质联用技术（GC-MS）分析萜类化合物和固醇。

使用这些方法来分析花序，叶片，茎皮和根的化学组成概况。

3.验证方法

对开发的方法进行了选择性、线性、准确性、精密度（重复性和日间日内精密度）、灵敏度（LOD、LOQ）和耐用性（使用不同的色谱柱及仪器）的验证。测量不确定度(准确性)是使用总误差概念确定的，另外还确定了的基质效应和提取效率。

实验结果

基于LC-ESI-MS的分析及验证

运用LC-MS靶向代谢组（精准靶向）测定方法，检测每种化合物的碎片离子质荷比（m/z）如下表1：

表1 |每种化合物的碎片离子质荷比（m/z）

运用LC-MS（精准靶向）测定的14种混合标准溶液的色谱图如图3a所示。回归曲线呈线性，并且计算了斜率和确定系数。所有14种大的相关系数均高于0.9998。每种化合物的截距均设为零，通过方差分析、检测限、定量限、重复性、日间精密度、相对偏差、所有测量不确定度、基质效应和提取效率进行验证分析，均未显示提取的有显著差异，验证了技术的稳定性；
 

图3 | 单萜和倍半萜、黄酮类、固醇和三萜的色谱图

（a）通过LC-ESI-MS对14种混合的标准溶液进行色谱分析；

（b）通过GC-MS对44种单萜和倍半萜的色谱图对应于标记数字的萜类化合物在e中列出；

（c）通过HPLC-UV-MS分析7种黄酮类的色谱图，质谱用于黄酮类的鉴定，而紫外检测器用于黄酮类的定量；

（d）通过GC-MS的3种固醇和3种三萜的色谱图；

（e）44种单萜和倍半萜的化合物名称

单萜和倍半萜的检测及方法验证

分别使用GC-MS（精准靶向）和GC-FID对没有有效标准品的萜类化合物进行鉴定和半定量。分析可用的萜类化合物标准品和样品将目标化合物的质谱与嵌入GC-MS系统的NIST质谱数据库中的数据进行比较。如果LRI和质谱都确认了目标化合物的身份，则可以通过比较目标化合物和浓度已知的相近洗脱化合物的响应面积，并假设相对响应因子对该化合物进行半定量。

使用GC-MS（精准靶向）平台分离单萜和倍半萜，质谱仪在选择离子监测（SIM）模式下运行。每种化合物的定量离子和定性离子列表见表2：

表2 |单萜和倍半萜每种化合物的定量离子和定性离子列表

所有44种萜类化合物的相关系数均高于0.9989。通过LOD、重复性、日间精密度、相对偏差、测量不确定度、耐用性测试十二个重复样品进行评估。就单萜和倍半萜的总产量而言，结果无显著差异。

基于HPLC-UV-MS黄酮类化合物定性定量分析

运用HPLC-UV-MS分析黄酮类化合物，每种化合物的碎片离子的m/z，定性定量出7种黄酮类化合物。如表3所示：

表3 |黄酮类化合物的碎片离子的m/z

所有七个化合物的相关系数均大于0.9997。通过回收率测定的七种黄酮类化合物经酸水解的准确度（木犀草素和芹菜素），与先前研究的木犀草素和芹菜素回收率分别为82％和81％。验证该方法可重复使用，同时运用日内精密度对花序样品的十二个叶子样品重复性进行验证；

固醇和三萜类化合物分析

基于GC-MS（精准靶向）平台定量三萜和甾醇，质谱仪以SIM模式运行。每种化合物定量定性离子见表4：

表4 |三萜和甾醇每种化合物定量定性离子

所有6种化合物的相关系数在0.9989和0.9999之间。LOD在0.17至0.26 µg / mL之间，LOQ在0.50至0.79 µg / mL之间。并对所有化合物重复性、日间精密度、相对偏差测量进行验证。

花序，叶片，茎皮和根中的分布

含量从花序到叶到茎皮和根依次减少（图4a），包含在所有三个chemovars。在所有三个chemovars茎皮中含有0.005％和0.008％的叶和花序中定量的如图4b所示。叶中总为1.10％和2.10％。这与先前报道的（1-2％和1.40-1.75％）吻合。在所有三个chemovars的花序中为15.77％-20.37之间，为典型的现代药物型chemovars。
 

图6 |根，茎皮，叶片和花序中的次生代谢产物分布图

（a）植物各部分中的总含量；（b）花序中的单个和总含量；（c）植物各部分中单萜和倍半萜的总含量；（d）花序中的单萜和倍半萜的总含量；（e）植物各部分中总黄酮含量；（f）花序中的总黄酮含量；（g）叶中的总黄酮含量；（h）植物各部分中的总固醇含量；（i）茎皮中的单个固醇含量；（j）根中的单个固醇含量；（k）植物各部分中三萜类化合物的总三萜含量；（l）三种化学疗法的茎皮中的单个和总三萜含量；（m）茎皮中的单个和总三萜含量。

花序，叶片，茎皮和根中的单萜体和倍半萜类化合物

在茎皮或根中未检出单萜和倍半萜类化合物（图4c）。在三种chemovar植物中，叶的总单萜和倍半萜在0.125％到0.278％之间，花序的总范围在1.283％到2.141％之间，少于先前研究报道的未受精花。在Chemovar I和Chemovar II中，扇叶中的总倍半萜含量高于总单萜类化合物，但在Chemovar III中却相当。当含量以比例表示时，这一观察结果更加清楚：倍半萜类化合物在Chemovar I和II中占总萜类化合物的约90％，在Chemovar III中占53种总萜类化合物。

花序，叶片，茎皮和根中的黄酮类成分

在植物中，共鉴定出26种黄酮类化合物，它们是甲基化和预酰化的苷元，或结合的o -糖苷或c -糖苷，分别是牡荆素，异牡荆苷，槲皮素，木犀草素，和芹菜素。在这项研究中，总黄酮含量表示为酸水解后这七个黄酮的总和。在根和茎皮中未检出黄酮类化合物，在花序中检出的黄酮类较少，而在叶中检出的黄酮类最高（图4e）。

花序，叶片，茎皮和根中的甾醇概况

总固醇含量表示为从花序，叶片，根部到茎皮的菜油甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇的总和（图4h）。三种固醇的比例与先前对根的研究一致。β-谷固醇是所有Chemovar中根和茎皮中最丰富的固醇，范围从0.04至0.06％（图4i，j）。根和茎皮中的菜油甾醇含量在0.01％至0.02％之间，在叶中未检出。豆甾醇在根和茎皮中的最低浓度为0.01％，在叶中的最高浓度为0.03％。三种Chemovar中茎皮中的总固醇具有可比性，而根部物质中的总固醇显著不同。菜油甾醇在三种Chemovar的茎皮中无显著差异，但在根系物质中有显著差异。豆甾醇在三种Chemovar的茎皮和根部物质中有显著差异。β-谷甾醇在三种Chemovar的根中显著不同。

三萜类化合物可控制花序，叶片，茎皮和根

三萜类化合物的总含量表示为β-锚蛋白，表无羁萜醇和无羁萜的总和。从花序到叶，茎皮和根依次增加（图4k）。Chemovar III的根和茎皮中的总三萜含量显著高于Chemovar I和II。无羁萜是中最显著的三萜类化合物，集中在茎皮和根中（图 4l，m）。结果表明该结果显著高于先前研究的0.00128％（12.8 mg/kg）。Chemovar III在茎皮和根中的无羁萜，表无羁萜醇和β-锚蛋白明显高于其他Chemovar。在叶片样品中均未发现表无羁萜醇或无羁萜。相反地，发现叶片中的β-amyrin含量较高，高于茎皮或根部。

相关讨论
 

为了桥接传统医学和现代循证医学，必须确定生物化学活性化合物，并通过临床前和临床研究确定其分子机制。本文作者概述各部分中定量的次生代谢产物，由于浓度超过0.05％具有药理学意义，花序和叶材可能含有足够的素，单萜和倍半萜以及黄酮类以用于治疗应用。茎皮和根是三萜和固醇的来源，干燥叶子中可以分离出来无羁萜，所含的无羁萜的含量是莎拉树的十倍以上。鉴定的化合物的潜在治疗性质已被全面回顾。例如萜类化合物和在花序和叶子识别黄酮类化合物具有抗炎、抗风湿、镇痛、抗惊厥、抗氧化和神经保护及杀幼虫，胃保护性，和对呼吸系统有益效果。在茎皮和根中鉴定出的三萜和甾醇具有抗炎、止痛、抗菌、抗氧化剂、神经保护、血管生成、抗骨关节炎和雌激素特性。这些次生代谢物具有药用价值，可能有助于的整体治疗效果；但是，这些协同作用需要进一步研究以提供直接证据。这些证据应来自使用材料的研究，而不是来自其他植物提取物的替代研究。

实验结论
 

这项研究是首次尝试全面（精准靶向策略）分析植物各个部分的次生代谢物组。本研究分析了3种不同品种的花序、叶、茎皮和根中的14种，47种萜类化合物（包括29种单萜类化合物，15种倍半萜类化合物和3种三萜类化合物），3种固醇和7种黄酮类。通过分析花序、叶片、茎皮和根等不同部位的包括、萜类化合物、固醇和黄酮类次生代谢物。花序和叶片中的、单萜类、倍半萜类和黄酮类相对丰富，茎皮和根含有三萜和固醇。这些具有生物活性的化合物可能是每一种植物的传统药用价值的基础。生物活性化合物的全面概况及其协同作用的深入研究使植物成分与治疗效果之间具有相关性，最终将传统草药与现代科学联系起来。这种方法使人们能够利用植物部分的全部或子集开发新的基于的药物。行业的未来趋势之一是通过应用现代科学方法论来验证其传统用途，从而充分利用的各个部分。

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本文亮点不仅运用精准靶向代谢组学作为研究手段，而且还运用了9大验证方法分析验证了花序、叶片、茎皮和根等不同部位中、萜类化合物、固醇和黄酮类等次级代谢物的分布特点，揭示了次生代谢产物作为活性化合物的药用价值及应用前景。

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部分文献参考

Turner, C. E., Elsohly, M. A. & Boeren, E. G. Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A review of the natural constituents. Journal of Natural Products 43, 169–234 (1980).

Ross, S. A. et al. Flavonoid glycosides and cannabinoids from the pollen of Cannabis sativa L. Phytochemical Analysis: An International. Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques 16, 45–48 (2005).

ElSohly, M. A. & Slade, D. Chemical constituents of marijuana: the complex mixture of natural cannabinoids. Life sciences 78, 539–548 (2005).

Pollastro, F., Minassi, A. & Fresu, L. G. Cannabis Phenolics and their Bioactivities. Current medicinal chemistry 25, 1160–1185 (2018).

Andre, C. M., Hausman, J.-F. & Guerriero, G. Cannabis sativa: The Plant of the Thousand and One Molecules. Frontiers in Plant Science 7, (2016).

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