Food Chemistry客户文章 | 福建农林大学运用脂质组学及靶向代谢组学对鱼卵的磷脂组成和分子结构研究

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前言 

本篇为鹿明生物合作客户福建农林大学食品科学学院陈丽娇教授课题组在《Food Chemistry》杂志（IF=5.399）发表的题目为“P. crocea鱼卵磷脂组成和分子结构”的研究论文，该研究报道了Pseudosciaena crocea鱼（P. crocea）鱼卵中磷脂（PLs）种类和分子类型的研究结果。为了充分研究鱼卵的PLs轮廓谱信息，作者使用多种代谢平台，包括GC-MS和HPLC-ELSD分别分析了鱼子的脂肪酸组成和PLs种类，以及使用UPLC-ESI-Q-TOF-MS平台确认了鱼卵中PLs的分子类型。

基本信息

英文标题：Phospholipids composition and molecular species of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) roe

中文标题：大黄鱼（Pseudosciaena crocea）鱼卵的磷脂组成和分子结构研究

材料：鱼卵

影响因子：5.399

发表期刊：Food Chemistry

运用鹿明生物技术：LC-MS脂质组学，GC-MS靶向代谢组学

研究背景

在中国南部，大黄鱼（Pseudosciaena crocea，P crocea）是最重要的经济海水鱼之一，在网箱养殖业中产量最高，2015年总产量可达148,600吨。因此近年来，P. crocea产品的加工开发和利用引起了较大关注，其中引起研究人员兴趣的一种产品是鱼卵中的磷脂。据报道鱼卵中含有大量n-多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA），主要是二十碳五烯酸（EPA，C20﹕5n-3）和二十二碳六烯酸（DHA，C22﹕6n-3），被认为具有预防冠心病、炎症和自身免疫性疾病，癌症等发病的功能。大多数n-3 PUFA以磷脂（PL）形式存在，其中磷脂酰胆碱（PC）是主要的磷脂种类。PLs是细胞膜的重要组成部分，在几乎所有已知的生物体中都具有重要的生理和生物功能，另外含有n-3 PUFA的PLs可能对调节肝脏和血浆的脂质水平起很大的作用。

表征和定量PLs的方法已经从传统的薄层色谱（TLC）发展到高效液相色谱（HPLC）以及更先进的质谱技术（MS）。HPLC-ELSD（蒸发光散射检测器）的应用报道比较多。GC-MS是测量食品中脂肪酸的传统方法，但有具有操作繁琐和分辨率差的缺点。最近发展起来的超高效液相色谱-电喷雾电离-四级杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-Q-TOFMS）技术具有分离度高、分辨率高、灵敏度高和分析速度快的优点，不仅可以更快速、更灵敏地检测分子种类并定量单个脂质，通过碰撞诱导解离（CID）功能可以特异性地得到脂质头部基团碎片，因此能全面解析脂质结构。上述平台结合使用，可全面表征脂质的种类和定量情况。

研究方案

实验方法

1.脂质化合物的提取与分离

（1）提取总脂质：鱼卵取出后于0-4℃保存，在24小时内提取总脂质。5.0g鱼卵匀浆，然后与60 mL/甲醇溶液（2:1，v/v）在玻璃管内混合并提取2小时。将混合物在65℃水浴中加热1小时，并在38℃将溶剂蒸发。

（2）分离PLs：使用硅胶柱色谱分离出PLs并储存在-20℃冰箱待进一步分析。

（3）分离脂肪酸：20-50mg的PLs用1mL 2mol/L的甲醇溶解，并在60℃水浴加热2分钟，然后加入1mL 含有2mol/L甲醇的HCl溶液并加热5分钟。然后加入2mL正己烷混匀，并在室温下静置1小时。最后收集含有脂肪酸混合物的正己烷层，并用无水硫酸钠干燥待GC-MS分析。

（4）分离脂质（用于质谱分析）：将约0.1g鱼卵样品和1.4mL（IPA）加入2mL离心管中涡旋混合1分钟、超声提取10分钟。将样品保持在冰箱（-20℃）中1小时，再冷冻离心10分钟，取上清液保存在冰箱（-20℃）中待后续分析。

2.检测方法

（1）    GC-MS：分析脂肪酸组成

（2）    HPLC-ELSD: 分析 PLs种类

（3）    UPLC-Q-TOF-MS：分析PLs分子类型

实验结果

1.GC-MS平台分析P. crocea鱼卵总PLs的脂肪酸组成

P. crocea鱼卵PLs脂肪酸组成如表1所示，可以看出PUFA的百分比占PLs总量的43％，其中有相当数量的DHA和EPA（含量分别为35％和6.9％）。总的来说，DHA含量最高、其次是棕榈酸（C16：0）、油酸（C18：1）、EPA和硬脂酸（C18：0）。许多文献也表明鱼卵PLs中EPA和DHA的浓度较高，可以看出，P. crocea鱼卵是获得EPA和DHA的很好的海洋资源。

表1P. crocea鱼卵总磷脂的脂肪酸组成（GC-MS方法）

2.HPLC-ELSD平台分析P. crocea鱼卵的PLs种类

图1显示了从P. crocea鱼卵提取的PLs的HPLC-ELSD色谱图。在P. crocea鱼卵中观察到三种PLs，分别为PC、PE和磷脂酰肌醇（PI），以及一种溶血磷脂（LPLs）——溶血磷脂酰胆碱（LPC）。PC的色谱峰分布较宽，可能是PC类磷脂中存在着多种脂肪酰基。从表2可以看出，PC是P. crocea鱼卵中含量最高的PLs（76.36±0.62％），可占PLs总量的一半以上。其次是LPC和PE，含量分别为12.30±0.55和9.12±0.02％。PI含量为1.09±0.01％。多篇文献也发现PC和PE是鱼卵中的主要PLs成分。作者的实验结果表明，P. crocea 鱼卵是富含PC、LPC和PE的海洋PLs的宝贵来源。

图1| PLs标准品和P. crocea鱼卵中PLs的HPLC-ELSD色谱图

（a）PC标准品; （b）PC标准品; （c）SM标准品; （d）LPC标准品; （e）LPC和PI标准品; （f）P. crocea鱼卵中PLs。

表2 P. crocea鱼卵磷脂的组成（HPLC-ELSD方法）

3.UPLC-Q-TOF-MS表征P. crocea鱼卵PLs的分子组成

使用UPLC-Q-TOF-MS对经（IPA）沉淀后的鱼卵提取物进行全扫描。TOF-MS可通过质量测量和同位素质量分布来识别元素组成。

图2为P. crocea鱼卵磷脂的总离子流图和质谱图（图2a和c分别问正离子和负离子模式的总离子流图，图2b和d是对应的质谱图）。通过分析质谱数据并通过Progenesis QI软件搜索脂质图结构数据库（http://www.lipidmaps.org）来鉴定PLs的特征性头基碎片离子，共鉴定出92个PL，包括49个PC，13个PE，10个PA，13个PS，3个PG，2个SM和2个PI（表3）。

图2|  P. crocea鱼卵磷脂的总离子流图和质谱图

（a）正离子模式下的总离子流图；（b）正离子模式的质谱图; （c）负模式下的总离子流图; （d）负离子模式的质谱图

PC被认为是构成细胞膜和肺表面活性剂的最重要的一种PLs。与标准样品的数据比较，作者确定了一些特征碎片离子。例如PC分子特有的磷酸胆碱基团在m/z 184处产生。根据断裂模式和分子量，共检测到49个PC。PC的主要分子种类是15﹕0/19﹕1＆16﹕0/18﹕1，O-18﹕0/22﹕6＆18﹕0/22﹕6，O-16﹕0/22﹕6＆P-16﹕0/22﹕6＆16﹕0/22﹕6和P-16﹕0/20﹕5＆16﹕0/20﹕5，其相对丰度分别占19.43％，11.52％，13.33％和15.79％。

PE是非双层结构，被认为是调节膜流动性的关键PLs。在正离子模式下，[M+H-141]+的碎片离子是通过在PE的sn-2位置上的极性头部磷酸基-生成的。两个特征碎片离子m/z 140 [C2H7O4NP]-和m/z 196 [C5H11O5NP]-在负离子模式下产生。根据以上特征确定了13个PE，主要分子种类为22﹕6/19﹕0，17﹕2/22从0和15﹕0/22﹕1，相对丰度分别为60.84、16.33和8.47％。

PA可以通过PC水解产生，并且是细胞膜的主要成分。PA在负离子模式下PA带负电荷，它的分子种类最多，分别为19﹕0/22﹕1、14﹕1/21﹕0、16﹕0/22﹕1和15﹕1/22﹕2，相对丰度分别为12.72、11.85、18.73和24.07%。

PS是带负电荷的PLs，通常在膜小叶中。可在正离子模式下根据极性头部基团[M-184]+的损失和在负离子模式下丝氨酸头部基团的中性损失（88个质量单位）来确定PS分子的种类。PS的主要分子种类为O-20﹕0/20﹕5、18﹕2/22﹕0和O-18﹕0/20﹕3，它们的相对丰度分别为32.72、29.46和12.00％。

表3 P. crocea鱼卵磷脂的分子类型（基于UPLC-Q TOFMS平台）

PG在膜中也普遍存在，对于植物的光合作用和生长必不可少，可以调节动物的先天免疫并执行特定功能，。在正离子模式下，PG可形成特征峰[M-171]+，并在负离子模式下生成m/z 171 [C3H8O6P]-和m/z 227 [C6H12O7P]-的两个特征峰。作者在样品中确认的PG分子为P-16﹕0/20﹕0（55.42％），O-16﹕0/22﹕2（38.99％）和16﹕0/22﹕0（5.59％）。

SM可以替代PC组成生物膜，并且还具有可调节不同信号通路的脂质筏。由于存在季氮原子，SM的碎片离子在阳离子模式下更为丰富。SM主要的分子类型是d18﹕1/24﹕1，在大黄花鱼卵中相对丰度为78.38％，其次是d18﹕2/24﹕1 占21.62％。

PI具有干预细胞表面受体和细胞内细胞器之间通讯的能力，由于PI由大量带负电的碎片离子组成，因此在负离子模式下可获得PI的更多信息。PI的特征碎片离子为[C6H10O8P]-（m/z 241）。鉴定出的两个PI分子类型分别为12﹕0/22﹕1和13﹕0/22﹕0，相对丰度分别为29.58和70.42％。

此外在大黄鱼卵PLs分子种类中，作者还确认了附着在磷酸基团的sn-1或sn-2位的主要脂肪酸类型，主要是C 14﹕0，C 16﹕0和C 18﹕0，并且PC、PE、PA和PS中主要的PUFA，尤其是DHA和EPA的丰度与GC-MS获得的结果一致。但UPLC-Q-TOF-MS方法与HPLC-ELSD相比，可给出更快速，更灵敏的PLs分子类型检测的详细结果。

值得注意的是，PLs种类的组成可能会受到饲料成分、饲养条件、捕捞季节等的影响，并且其含量可能因不同的检测方法而略有不同。

实验结论

作者利用气相色谱-质谱（GC-MS）和带有蒸发光散射检测器的高效液相色谱（HPLC-ELSD）分别分析了P. crocea鱼卵PLs脂肪酸的组成并鉴定了PLs种类。实验发现总PLs中磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰（PE）和磷脂酰肌醇（PI）分别占76.36±0.62％、12.30±0.55％、9.12±0.02％和1.09±0.01％。此外通过超高效液相色谱-电喷雾电离-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）表征PLs的分子组成，共鉴定出共92种PLs，包括49种PC、13种PE、10种磷脂酸（PAs）、13种磷脂酰丝氨酸（PSs）3种磷脂酰甘油（PGs）、2种鞘磷脂（SMs）和2种磷脂酰肌醇（PIs）

推荐语

代谢组学既是一门学科，也是一项非常有用的技术，不仅在生物标志物发掘、分子机制研究等领域发挥重要作用，也可应用于食品、环境等多个领域。作者利用两种最常见的代谢组学平台（GC-MS和UPLC-Q-TOF-MS）并结合HPLC-ELSD技术全面、系统地表征了我国沿海常见的经济鱼类P. crocea鱼卵中磷脂的组成。通过多种手段的联合分析，在获得鱼卵各种磷脂的定量信息同时，还能得到脂肪酸等详细的分子组成信息，充分证明了代谢组学技术应用的和广泛性和可靠性。

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参考文献

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1. Ali, A. H., Zou, X., Lu, J., Abed, S. M., Yao, Y., Tao, G., ... Wang, X. (2017). Identification of phospholipids classes and molecular species in different types of egg yolk by using UPLC-Q-TOF-MS. Food Chemistry, 221, 58–66.

2. Bledsoe, G. E., Bledsoe, C. D., & Rasco, B. (2003). Caviars and fish roe products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43(3), 317–356.

3. Bligh, E. G., & Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 37(8), 911–917.

4. Brouwers, J. F. H. M., Vernooij, E. A. A. M., Tielens, A. G. M., & Van Golde, L. M. G. (1999). Rapid separation and identification of phosphatidylethanolamine molecular species. The Journal of Lipid Research, 40(1), 164–169.

5. Burri, L., Hoem, N., Banni, S., & Berge, K. (2012). Marine omega-3 phospholipids: metabolism and biological activities. International Journal of Molecular Sciences, 13(11), 15401–15419.

6. Cejas, R. J., Almansa, E., Villamandos, E. J., Badía, P., Bolaños, A., & Lorenzob, A. (2003). Lipid and fatty acid composition of ovaries from wild fish and ovaries and eggs from captive fish of white sea bream (Diplodus sargus). Aquaculture, 216, 299–313.

7. Dasgupta, S., & Bhattacharyya, D. K. (2007). Dietary effect of eicosapentaenoic acid (EPA) containing soyphospholipid. Japan Oil Chemists’ Society, 56(11), 563–568.

8. Donato, P., Cacciola, F., Cichello, F., Russo, M., Dugo, P., & Mondello, L. (2011). Determination of phospholipids in milk samples by means of hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to evaporative light scattering and mass spectrometry detection. Journal of Chromatography A, 1218(37), 6476–6482.

9. Doria, M. L., Cotrim, Z., Macedo, B., Simoes, C., Domingues, P., Helguero, L., & Domingues, M. R. (2012). Lipidomic approach to identify patterns in phospholipid profiles and define class differences in mammary epithelial and breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment, 133(2), 635–648.

10.Fong, B., Ma, L., & Norris, C. (2013). Analysis of phospholipids in infant formulas using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(4), 858–865.

11. Frentzen, M. (2004). Phosphatidylglycerol and sulfoquinovosyldiacylglycerol: Anionic membrane lipids and phosphate regulation. Current Opinion in Plant Biology, 7(3), 270–276.

END