Autophagy项目文章 | 上海交通大学医学院运用IncRNA、iTRAQ研究诱导自噬抑制葡萄膜黑色素瘤的发生机理

前言

葡萄膜恶性黑色素瘤是成年人中最多见的一种恶性眼内肿瘤，在国外其发病率占眼内肿瘤的首位，在国内则仅次于视网膜母细胞瘤，居眼内肿瘤的第二位。此瘤的恶性程度高，眼后是好发部位。易经血流转移，85%转移至肝脏。本篇由欧易/鹿明生物合作客户上海交通大学医学院范先群教授课题组发表在《Autophagy》的”ZNNT1 long noncoding RNA induces autophagy to inhibit tumorigenesis of uveal melanoma by regulating key autophagy gene expression“运用欧易/鹿明生物lncRNA 芯片、iTRAQ 蛋白质定量技术探究lncRNA 在 UM 肿瘤发生中的作用报道。

基本信息

论文题目：ZNNT1 long noncoding RNA induces autophagy to inhibit tumorigenesis of uveal melanoma by regulating key autophagy gene expression

发表期刊：Autophagy

影响因子：11.059

上海交通大学医学院李鹏、何杰、阳志为共同第一作者，上海交通大学医学院范先群教授、钟清研究员和同济大学张赫教授为共同通讯作者。

文章中 lncRNA 芯片、iTRAQ 蛋白质定量技术由欧易/鹿明生物提供服务。

研究背景

lncRNA 在多种肿瘤发生、发展中发挥重要作用。葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma ,UM）是成人最常见的眼内恶性原发性肿瘤，恶性程度高，大约 50% 的原发性 UM 患者最终会发生远端转移，死亡率高。目前，lncRNA 在 UM 肿瘤发生中的作用报道较少。

研究内容

本研究通过在 UM 细胞中使用 MTOR 抑制剂后进行 lncRNA 芯片筛选，发现一个显著上调的 lncRNA ZNNT1。过表达 ZNNT1 可以上调 ATG12 的表达，促进细胞自噬，抑制 UM 肿瘤发生和转移的能力。而 knockdown ZNNT1 可以抑制细胞自噬。体内实验表明，ZNNT1 可以抑制裸鼠黑色素瘤的生长。Knockdown ATG12 可以部分缓解 ZNNT1 引起的肿瘤抑制作用。以上研究表明，lncRNAZNNT1 通过 ATG12 促进细胞自噬，在葡萄膜黑色素瘤中发挥抑癌基因作用。

研究线路

研究结果

1. lncRNA ZNNT1 是 MTOR 的下游分子。

为研究葡萄膜黑色素瘤中细胞自噬的作用，使用 MTOR 抑制剂雷帕霉素和 PP242 对 UM 细胞进行处理，结果显示 MTOR 抑制剂促进了 UM 细胞自噬。通过lncRNA 芯片对处理前后的细胞进行筛选，共有 42 个lncRNA 表达量发生了显著改变（下图 C），RT-PCR 验证显示 lncRNA n341569 发生了显著上调（下图 D, E）。通过 RACE 实验克隆了该 lncRNA 的全长，命名为 ZNNT1。

图 1 ｜lncRNA ZNNT1 是细胞自噬相关的 lncRNA

C: lncRNA 芯片结果；D, E: RT-PCR 结果；F: ZNNT1 基因结构

2. ZNNT1 调控 ATG12 的表达。

细胞亚定位显示 ZNNT1 主要位于细胞核内。为研究 ZNNT1 的作用机制，在 UM 细胞中过表达 ZNNT1 后，利用定量蛋白组技术 iTRAQ 检测显示共有 231 个蛋白质表达发生了显著改变，其中 ATG12 表达量上调近 2 倍（下图 C, D），RT-PCR 也显示 ATG12 在 mRNA 水平也发生上调（下图 E）。ATG12 是一个泛素样蛋白，与 ATG5 结合促进 LC3/Atg8 的脂化并指导其在自噬体上的定位。

图 2 ｜lncRNA ZNNT1 促进 ATG12 表达

C: iTRAQ 结果；D: ATG12 蛋白的表达水平；E: ATG12 mRNA 的表达水平

3. ZNNT1 促进细胞自噬。

WB 实验显示过表达 ZNNT1 会促进用 LC3-I 转化为 LC3-II，以及 SQSTM1 的降解，这些指标表明细胞自噬现象的发生。同时，将 ATG5 knocking down 之后，可以中和 ZNNT1 过表达所引起的自噬反应。

图 3 ｜lncRNA ZNNT1 促进细胞自噬

A, B: ZNNT1 过表达后，细胞自噬相关蛋白的表达；D: ZNNT1 过表达同时敲低 ATG5 表达后，细胞自噬相关蛋白的表达

4. ZNNT1 抑制 UM 细胞的肿瘤发生和转移能力。

过表达 ZNNT1 可以抑制 UM 肿瘤细胞的生长（下图 A, B）、促进细胞死亡（下图 C）。transwell 实验也显示 ZNNT1 的过表达可以抑制 UM 细胞的迁移能力（下图 D）。

图 4 ｜lncRNA ZNNT1 抑制 UM 肿瘤发生和转移

5. ZNNT1 缺失可以中和 UM 细胞自噬。

在 UM 细胞中 knockdown ZNNT1，可以显著抑制 PP242 和雷帕霉素引发的细胞自噬，降低 LC3-I 向 LC3-II 的转化和 SQSTM1 的降解。

图 5 ｜lncRNA ZNNT1 敲低抑制细胞自噬

6. ZNNT1 在体内抑制肿瘤生长。

与对照相比，在裸鼠体内过表达 ZNNT1 可以减缓肿瘤的生长。而在临床黑色素瘤组织样品中，ZNNT1 的表达水平显著低于正常组织。

图 6 ｜lncRNA ZNNT1 抑制肿瘤生长

7. ATG12 敲低可以部分抑制 ZNNT1 介导的肿瘤抑制作用。

在 ZNNT1 过表达的 UM 细胞中，同时 knockdown ATG12，结果显示 LC3-I 向 LC3-II 转化、SQSTM1 降解减少，促进肿瘤细胞增殖和转移。

研究结论 

本研究表明，在葡萄膜黑色素瘤中，lncRNA ZNNT1 起到了抑癌基因作用。ZNNT1 可以通过上调 ATG12 表达，调控 ATG12-ATG5 结合，促进细胞自噬，进而抑制了肿瘤的发生。本研究通过运用lncRNA 芯片、iTRAQ 蛋白质定量技术为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供了新的思路。

参考文献

Li P, He J, Yang Z, et al. ZNNT1 long noncoding RNA induces autophagy to inhibit tumorigenesis of uveal melanoma by regulating key autophagy gene expression. Autophagy 2019; doi: 10.1080/15548627.2019.1659614.

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