EST客户文章 | 南京大学赵丽娟教授课题组运用GC-MS代谢组学揭示黄瓜应对银纳米粒子诱导的氧化应激代谢重构研究

发布时间： 2019-09-10 12:43 来源：上海鹿明生物科技有限公司

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前言

南京大学环境学院污染控制与资源化利用国家重点实验室赵丽娟教授课题组在Environ. Sci. Technol杂志（IF=7.149）发表了题目为“代谢组学揭示黄瓜应对银纳米粒子诱导的氧化应激代谢重构”的研究论文，该研究运用GC-MS代谢组学研究报道了在银纳米粒子暴露下黄瓜叶片代谢谱变化情况，并首次阐述了黄瓜叶片在氧化应激条件下可能的代谢机制。

基本信息

英文标题：Metabolomics Reveals How Cucumber (Cucumis sativus) Reprograms Metabolites To Cope with Silver Ions and Silver Nanoparticle-Induced Oxidative Stress

中文标题：代谢组学揭示黄瓜应对银纳米粒子诱导的氧化应激代谢重构

材料：黄瓜幼苗叶片

影响因子：7.149

发表期刊：Environmental Science & Technology

主要运用鹿明生物技术：GC-MS普筛

封面图

研究背景

银纳米粒子（AgNPs）由于其显著的抗真菌活性，作为纳米杀菌剂在农业方面的应用有很大潜力。但是出于食品安全生产的考虑，严格评估AgNPs对植物的影响十分必要。因此在本研究中，培养了4周的黄瓜（Cucumis sativus）叶片，使用Ag⁺离子处理（每颗植株0.04或0.4 mg）或AgNPs处理（每颗植株4或40 mg）各7天，处理后的叶片进行气相色谱-质谱非靶标代谢组学研究（GC-MS），多变量分析结果显示，经过处理叶片的代谢谱均发生改变。

研究思路

实验方法

1.实验分组及前处理

生长4周的黄瓜幼苗在叶面喷洒AgNPs或Ag⁺离子溶液，持续7天。共有5种处理方式，包括对照组（无Ag⁺离子或AgNPs），0.04和0.4mg 的Ag⁺离子处理组，以及4和40mg的AgNPs 处理组，每个处理组都有5个生物学重复。

2.检测方法

（1）Ag⁺离子含量检测：电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）；

（2）脂质过氧化评估：通过硫代酸反应物质（TBARS）测定法检测叶中的脂质过氧化的程度。丙二醛（MSA）是脂肪酸降解的最终产物，可用于表征脂质过氧化；

（3）代谢组分析：GC-MS非靶标

结果分析

1.银纳米粒子和银离子的积累和对生理表型的影响

表型变化：AgNPs和Ag⁺离子暴露使Ag在黄瓜组织中显著积累。0.04mg Ag⁺离子处理不会在叶片产生明显的毒性，然而0.4mg Ag⁺离子处理在第4天诱导叶片黄化，这表明叶片患萎黄病并开始衰老。两种浓度（4和40 mg / L）的AgNPs都会造成类似的叶片损伤，较高剂量也会引起脱水。

脂质过氧化：与对照组相比，暴露于4和40 mg AgNPs的黄瓜叶中丙二醛（MDA）含量显着增加（分别为28.6％和44.93％; p<0.05）（图1）。MDA是多不饱和脂肪酸氧化的最终产物，可直接反映氧化应激诱导的脂质损伤的程度。较高含量的MDA表明脂质过氧化增加，尤其是在含有较多不饱和脂肪酸的叶子中。本实验MDA中增加表明AgNPs暴露可造成显著的膜损伤。重要的是，相对于对照，两种低剂量（0.04和4mg / L）的Ag⁺离子处理均未诱导脂质过氧化。作者根据文献推测，AgNPs处理引起的损伤可能是离子释放的结果，而不是纳米颗粒暴露的结果。

图1 | 在用不同剂量AgNPs和Ag+离子处理7天后的黄瓜叶片的脂质过氧化

生物量：研究人员发现对照组和Ag⁺/ AgNPs处理的植株相比，根、茎和叶的生物量没有显着变化，与其他处理相比，100 mg/L的AgNPs显著（p<0.05）降低了根的生物量，除此之外，对照组和Ag处理在总生物量方面没有差异。与生物量这样粗略的测量相比，植物组织内分子的变化更加敏感。

2.黄瓜对银纳米粒子和银离子的代谢响应

使用GC-MS非靶标方法，总共鉴定出268种代谢物，基于质谱指纹和保留指数匹配对它们进行半定量，然后通过主成分分析（PCA）进行无监督的聚类分析。PCA得分图（图2左）显示0.04mg Ag⁺离子基团（B组）和对照组（A组）之间没有明显的分离；但其他处理（0.4 mgAg⁺离子，4和40 mg AgNPs）沿着第一主成分（PC1）方向与对照组明显区分。在PCA模型中0.4mg Ag⁺离子（C组）和4mg AgNP（D组）之间未观察到明显的分离。

为了将组间分离最大化，进行了基于GC-MS数据集的PLS-DA多变量分析。得分图（图2右）显示所有AgNPs和Ag⁺离子组与对照明显分开，并且显示出沿PC1方向的分离与剂量相关。这些结果表明AgNPs和Ag⁺离子都可改变黄瓜叶片的代谢特征。

图2 | 不同剂量的AgNPs和Ag+离子处理的黄瓜叶片代谢谱的得分图

（左）主成分分析（PCA）和（右）偏最小二乘判别分析（PLS-DA）

根据VIP > 1的标准筛选差异性代谢物，一共筛选出区分对照和所有Ag处理组的40种代谢物。为了进一步区分Ag⁺离子和AgNPs响应，分别对Ag⁺离子组与对照、AgNPs与对照进行PLS-DA分析，用于筛选出有Ag+离子和AgNPs特异性的代谢物，同时对这些代谢物进行单变量统计分析（方差分析和ANOVA）。作者观察到，很多代谢物均受AgNPs和Ag⁺离子的影响（显著变化的代谢物76个，其中21个含量下调和55个上调）。这个结果表明AgNPs诱导的应激变化，主要源自纳米材料释放的Ag⁺离子毒性。但是有一些代谢物变化是有AgNPs特异性的，这表明确实存在纳米粒子效应。

3.受银离子和银纳米粒子影响的差异代谢物

在93种显著改变的代谢物中，76种（接近82％）是由Ag⁺离子和AgNPs暴露导致的，突出了离子释放对植物反应的重要性。

（1）植醇

植醇（Phytol）是叶绿素的降解产物，植醇累积的增加表明叶绿素降解。研究者发现随着Ag⁺离子和AgNPs暴露剂量的增加，植醇含量显著增加（1.5-2.2倍）（图3）。上面的内容提到，MDA增加（图1）表明氧化应激和脂质过氧化。胁迫条件下叶绿体的降解和其营养物的再循环十分重要，叶绿素降解产物植醇被用于合成生育酚（一种重要的脂溶性抗氧化剂），可以保护脂质免受氧化损伤。因此叶绿素降解为植醇可能是黄瓜对抗氧化应激的一种积极保护机制。此外植醇具有抗菌性，并且还受水分胁迫诱导，因此成为植物抗应激的常见生物标志物。

图3 | AgNPs暴露下发生改变的黄瓜叶片代谢途径示意图（红色-上调；绿色-下调）

（2）抗氧化剂

β-葡萄糖苷和酚酸：在熊果苷和水杨苷的VIP得分最高，表明这两种化合物对于对照组和处理组之间的分离有显著贡献。不过在对照组和0.04 mg Ag⁺离子处理中未检测到熊果苷和水杨苷，但它们在0.4 mg Ag⁺离子和两种AgNPs处理组中显著上调（p<0.01）（图4）。水杨苷和熊果苷分别是醇类和酚类糖苷，它们可以作为自由基清除剂或信号分子参与黄瓜植物对抗Ag诱导的应激防御。

芳香族化合物：所有Ag⁺ / AgNPs处理均显著增加芳香族化合物的含量（图4），包括4-羟基喹唑啉（4-HQ），3-羟基苯（酚酸），1,2,4-苯三醇（BT）和连苯三酚（p <0.05），说明它们对这种金属的存在非常敏感。已发现4-HQ可限制质膜NADH氧化酶产生的ROS的增加，1,2,4-苯三醇（BT）是苯的多酚代谢产物，已被证明可显着减少H2O2诱导的ROS的产生。这些化合物的显著增加可能与氧化应激淬灭以及一般防御有关。稍微不同的是，顺式-2-羟基肉桂酸，阿魏酸和肉桂酸乙酯没有被0.04 mg Ag⁺离子改变，但是在其他Ag⁺离子处理时显著增加（图4）。这些芳香族化合物的上调可能是黄瓜应对Ag胁迫所采用的另一种主动保护机制。生物途径分析还揭示苯丙氨酸代谢途径是应激反应相关的生物途径，在40mg AgNPs剂量下受到扰动。作者推断抗氧化防御系统被AgNPs激活，这可能导致细胞的能量代谢途径从生长模式转变为防御模式，从而导致积累防御相关代谢物。

图4 | 暴露于不同剂量Ag +离子或AgNPs下的4周龄黄瓜叶中抗氧化代谢物的相对丰度箱形图

（3）三羧酸循环

琥珀酸是三羧酸（TCA）循环的中间体，在Ag暴露中以剂量依赖性方式显著增加（图5）。除0.04 mg Ag⁺离子外，在其他处理组中琥珀酸含量显著增加（p < 0.05，0.6-1.7倍）。另一种TCA循环中间体异柠檬酸在暴露在40mg AgNPs后增加了2倍。TCA循环中间体含量的上调显示出TCA途径被激活。TCA循环是细胞呼吸机制的核心，植物可能通过激活TCA循环产生能量，并用于制造应对氧化应激所需的防御化合物。

（4）糖和糖醇

糖是植物代谢调节的重要信号分子，在胁迫过程中它们会在衰老的叶片中积累。在0.4mg Ag⁺离子、4和40mg AgNPs暴露下，左旋葡聚糖和龙胆二糖积累量显著增加（p < 0.05，图5）。此外几种糖醇，包括苏糖醇，D-阿拉伯糖醇和山梨糖醇，在0.04mgAg⁺离子下不受影响，但与其他Ag处理剂量有显著依赖性（p < 0.05）。多元糖醇有助于在叶子衰老期间维持细胞水合和功能，多元醇含量增加可能在植物胁迫耐受性中起重要作用。

图5 | 暴露于不同剂量Ag+离子或AgNPs下的4周龄黄瓜叶中糖代谢物的相对丰度箱形图

（5）氮代谢

AgNPs和Ag⁺离子引起黄瓜叶片氨基酸组成的显著变化（图3）。

氨基酸代谢是植物初生代谢途径的重要组成部分，在植物生理过程中起重要作用。本文结果显示，8种氨基酸在Ag暴露下含量显着增加（图6），包括鸟氨酸、环亮氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和β-丙氨酸。这几种氨基酸的积累表明氮代谢受到AgNPs的干扰或者叶片中发生蛋白质显著降解。一个例外是N-甲基-DL-丙氨酸，暴露在0.04mg Ag⁺离子下含量没有改变，但随着Ag⁺离子和AgNPs剂量的增加，在其他处理组中含量降低，目前原因尚不清楚。

两种重要的酰胺——谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）在0.04mg Ag⁺离子处理组中未被发现。但随着暴露浓度的增加，其含量降低。与对照组相比，在40mg AgNPs暴露下，Gln和Asn显著降低4倍和15倍（p<0.05）。Gln和Asn是叶片中富含N的主要氨基酸，参与固定无机氮，这两种氨基酸的减少表明这一重要过程可能会受到干扰。

经过Ag处理后甘氨酸含量降低，但丝氨酸表达水平随着Ag剂量的增加而增加（图3）。甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）是光呼吸过程形成的两种必需氨基酸，Gly / Ser比率通常用作光呼吸活动的指标。暴露于40毫克AgNPs后，Gly / Ser比率降低了3倍，表明在这种情况下光呼吸受到抑制。

图6 | 暴露于不同剂量Ag+离子或AgNPs下的4周龄黄瓜叶中氨基酸代谢物的相对丰度箱形图

（6）脂肪酸

十五烷酸是一种饱和磷脂脂肪酸，与Ag⁺离子和AgNPs呈剂量依赖性显著增加（p < 0.05，图7）。十五烷酸是组成磷脂双层的成分，其含量增加指示出植物为了适应不利条件的膜重塑或合成。鉴于MDA含量增加，十五烷酸含量的上调可能用于修复受损的膜。

在0.04mg Ag⁺离子处理时不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸未改变，但在其他Ag暴露水平下显著降低（p < 0.05），例如40mg AgNPs时降低约1倍。已知当植物在适应生物和非生物胁迫时，可通过从膜脂质释放α-亚麻酸（18：3）来重塑膜流动性。花生四烯酸（一种不饱和的磷脂脂肪酸）不受0.04 mg Ag⁺离子的影响，但在较高的Ag+和AgNPs处理中显著增加了1-6倍（p<0.05）。这些代谢物变化表明，暴露在Ag下，完整的脂质膜会被破坏。脂质过氧化是细胞膜中不饱和脂肪酸自由基产生的一种导致细胞膜受损连锁反应。显然观察到脂肪酸代谢物上调或下调的一个潜在原因是脂质过氧化的结果。另一种可能性是植物调节膜组成以重建膜完整性并限制Ag⁺离子渗透到细胞中。磷脂由极性头部基团、甘油酯和两个脂肪酰基链组成。作者发现磷脂的极性头部组成，双甘油在暴露于40mg AgNPs后显著增加了2.3倍（p<0.05，图7）。这些发现支持了黄瓜叶片改变细胞内代谢以重建膜完整性的假设。

图7 | 暴露于不同剂量Ag+离子或AgNPs下的4周龄黄瓜叶中脂肪酸代谢物的相对丰度箱形图

（7）水杨酸

水杨酸（SA）是一种信号分子和植物激素，在植物防御中起重要作用。与大多数不受0.04 mg Ag⁺离子影响的代谢物不同，SA在较低离子剂量下显著增加（p<0.05），并且受组织中Ag含量影响（图3）。值得注意的是，当暴露于40mg AgNPs时， SA含量增加了8倍。SA是激活植物防御反应的信号分子，包括系统获得性抗性（SAR），SA还影响苯途径，并在病原体、某些害虫和其他非生物胁迫中发挥重要作用。SA的上调显然与黄瓜对Ag诱导的应激反应的广泛防御行为相关。除信号分子外，AgNPs还诱导了与防御相关的次生代谢产物的显著变化。

（8)银纳米粒子特异性反应

作者发现一些代谢物仅在AgNPs处理组中上调或下调，表明纳米材料对对植物有特异性影响。在AgNPs组中，特异性上调的代谢物包括、棉子糖、乳果糖、柠康酸、天冬氨酸、二硫赤藓糖醇、D-赤藓糖内酯和N-甲基-L-谷氨酸。在对照和Ag⁺离子处理的植物中未检测到、棉子糖、乳果糖和柠康酸，但在AgNPs处理的植物中显著变化。值得注意的是，与对照组相比，暴露于40mg AgNPs的N-甲基-L-谷氨酸增加了116倍。已知的具有生物抗氧化活性的化合物。在对照组和Ag⁺离子处理的植物叶中未检测到棉子糖和乳果糖，但它们在40毫克AgNPs时显著增加。据报道棉子糖虽然没有在能量代谢发挥作用，但会在植物中积累以应对非生物胁迫，如干旱、极端温度和盐度。因此推测棉子糖可能参与膜保护和清除自由基，以响应由盐或低温引起的氧化损伤。棉子糖与氧化膜损伤和ROS清除中的还原过程有关，这可以解释其在暴露40mg AgNPs与MDA同时增加。

在AgNPs处理组中，一些代谢物发生了显着下调（变化8-17倍），包括乙酰、对、草酸、草氨酸和乳酰胺。目前这些化合物下调的代谢机制尚不清楚。

实验结论

本文作者使用了GC-MS非靶标代谢组学方法，对暴露于AgNPs和Ag⁺离子黄瓜叶片代谢途径变化进行研究，并提出了自己的见解。

文章数据表明，在4和40 mg AgNPs诱导下，黄瓜出现了明显中毒症状和脂质过氧化，这两种剂量都导致了叶片代谢物谱的改变。对AgNPs毒性的研究对其未来在农业的应用非常重要。代谢组学分析是一种强有力的工具，揭示了植物采用多种策略来增强对AgNPs或Ag⁺离子诱导的氧化应激的耐受性，包括调节膜磷脂组成、增加糖和糖醇水平以及激活抗氧化防御途径。

这些发现为了解植物对AgNPs诱导的应激反应所涉及的分子机制提供了非常有价值的信息，并有助于寻求准确表征这些材料在环境中的风险，以及开发可持续的纳米植物保护策略。

本文是一篇非常典型的使用GC-MS非靶标代谢技术研究应激条件下植物代谢途径的文章，作者系统地研究了4周龄黄瓜叶片在AgNPs和Ag⁺离子诱导下发生的代谢途径重构，不仅考察了不同剂量水平Ag⁺离子暴露的影响，还特别研究了AgNPs纳米粒子对黄瓜代谢产物特异性的影响。作者对差异代谢物的研究十分深入，证据翔实，是一篇非常值得借鉴的非靶标代谢组学论文。

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