蛋白组学常见问题汇总解答（上篇）

你好，小鹿，我想做蛋白组学相关技术？

你好，小鹿，我想咨询itraq技术？

你好，小鹿……

小鹿经常收到来自客户关于蛋白组学和代谢组学等多层组学的各种技术问题，想必这些问题也可能是您关心的问题哦。那么今天小鹿特此给大家汇总一下蛋白组学和代谢组学的常见问题及解答哦。福利来咯，大家可以看看有没有你关心的问题哦

今天我们推出蛋白组学部分问题集锦，保证下面这些全面详细的蛋白组学问题解答知乎都做不到哦，而臣妾做得到呢（给小鹿点个赞）
 

问题1：蛋白质谱鉴定不成功一般有哪些因素? 

答：质谱鉴定不成功主要可以分为两类，一类是质谱效果不好，一类是没有可参考的蛋白数据库。质谱效果不好的原因又可以细分为蛋白点太淡以至于蛋白含量过低（常见银染的点）、蛋白酶解及质谱操作失误等。要避免这些因素需要尽量取颜色深一些的蛋白点，并且取的蛋白点面积需要适当大一些，对于某些很小但很清晰的蛋白点，取点的时候可适当选择孔径大一些的枪头，把边上空白处适当取到一些也不要紧，避免取点混入其他的蛋白点。其次，由于没有合适的数据库导致的鉴定效果较差，可以通过更换范围更大的数据库、近缘物种数据库、采用相关研究物种的蛋白、EST数据库等构建本地数据库的方式进行解决。
 

问题2：凝胶内的蛋白样品是否可以长期保存？如何运输？对质谱鉴定有何影响？

答：如果保存时间超过一周，可以将蛋白点切取后放入-20℃或者-80℃冰箱保存；如果小于一周，则可以常温保持，基本不会影响后续质谱鉴定效果，运送时常温快递即可。
 

问题3：iTRAQ/TMT技术相对于电泳技术有什么优势? 

答：2-DGE是伴随着MALDI-TOF技术发展起来的蛋白质分离技术，理论上可以通过等电点(IEF)和分子量(SDS-PAGE)的差异将总蛋白质逐一分开，实际情况并不理想，因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见，蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等，一张2-DGE能鉴定到的蛋白质总数最多1000～2000蛋白。相较于2-DE以及DIGE等基于电泳的技术，iTRAQ/TMT分辨率高，博苑生物进行的细胞样品最多有发现超过6000个蛋白，并且绝大多数蛋白都有定量和定性信息；其次iTRAQ通量高，可以一次最多完成8个样品的实验，如果使用TMT技术最多可以一次完成10个样品的实验，特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。最后，鹿明生物提供的iTRAQ完整实验服务中包括 iTRAQ/TMT 实验中鉴定到的所有蛋白的定性和定量结果、差异筛选结果、并且免费提供差异蛋白的维恩图分析、聚类分析、热图分析、GO、Pathway、蛋白互作等生物信息学分析内容以及中英文双语的分析报告，除此之外还可以根据客户的需求提供个性化的服务，免去了数据分析的烦恼。

问题4：iTRAQ/TMT实验的主要步骤有哪些，主要采用哪些仪器？能得到什么数据及什么生物信息分析结果？ 

答：实验步骤包括：蛋白提取、浓度测定及SDS-PAGE凝胶检测，质检报告；蛋白酶解、同位素标记；一维色谱分离，冻干机冻干；高分辨LCMSMS质谱检测；搜库定性、定量分析；差异蛋白筛选，差异蛋白生物信息学分析；完整报告整理。

目前常用的仪器有：AB 5600 Triple TOF、Thermo Q Exactive Orbitrap；

数据分析包括：统计学分析（火山图、韦恩图、热图、聚类等）、GO富集、Pathway 通路分析、PPI网络分析。

问题5 ： iTRAQ/TMT实验的中 “组分” 或者 “SCX分级”代表什么？

答：iTRAQ/TMT实验对肽段进行的是2D-LC-MS，其中第一维的色谱分析主要采用的是SCX或者高pH值的HPLC对标记好的肽段混合样品进行初步分离,而将样品分离成10个组分，以此来达到降低每个组分中肽段样品的复杂程度，然后再将这十个组分分别在进行LC-MS，以便能达到更好的质谱鉴定效果。

问题6：对于iTRAQ下机的原始数据，使用什么软件进行质谱鉴定分析？如何判断差异蛋白？

答：我们采用与Triple TOF 5600 plus配套的proteinpilot 5.0v。已经有大量使用该软件发表的蛋白质组相关文献，是一款被广泛认可的蛋白质组鉴定、定量软件。目前对于差异蛋白筛选的条件没有统一的标准，实际筛选过程中需要我们结果具体的实验结果进行灵活的变化，尽量控制每组的差异蛋白总数在200左右或者鉴定结果总蛋白数目的10%左右，比较有利于我们进行后续的生物信息学分析。一般可信蛋白筛选可以根据FDR、unused和unique peptide来进行筛选。对于定量差异蛋白的评判标准，一般按照Flod change和P-value 等值来进行筛选。

问题 7：蛋白质谱鉴定不成功一般有哪些因素?没有全基因组测序的物种能否做蛋白质组？ 

答：目前已经有大量的物种完成了全基因组测序，并预测了相应的基因，未测序的物种可以通过近缘物种的基因序列作为数据库进行蛋白质组的研究，如果没有较好的近缘物种也可以使用稍大一些的属或者科的数据库进行检索。除此之外，如果研究人员做过转录组亦可以使用相关的数据建立本地库进行蛋白的质谱鉴定数据库。

问题8：为什么通过elisa、WB能检测到的蛋白在itraq实验中没有检测到？

答：人血浆中的蛋白是有上万种的，而一般质谱只能检测到五六百种，也就是说只占了其中的百分之几，这是普遍现象，说明咱们的方法是不存在问题的；其次，ELISA/WB与质谱相对来说灵敏度不一样，前者具有放大效应，因为其间会用到相应的抗体，所以只要选对抗体，感兴趣的蛋白基本都会被检测到；因此， ELISA/WB检测到的蛋白在组学中没有被检测到也是正常的。

问题9：我们itraq的结果，客户做验证，用elisa验证了两个差异蛋白，发现都是阴性结果，客户问这个是什么情况，出现阴性的概率有多大？一般我们会提到这个概率吗？

答：iTRAQ结果中，他选的蛋白是否得分够高，变化倍数大不大，选择的抗体特异性是否好，都可能会影响WB和iTRAQ的结果，我们之前有一些客户做过，如果以上三方面没有什么问题的话，基本上80%还是方向一致的。

问题10：iTRAQ、TMT、Labe lfree实验用的是什么质谱仪，其定量是基于一级质谱还是二级质谱？

答：基于LC-MSMS的实验技术主要使用的是ABI5600-Triple-TOF，同时公司也具有Thermo Q-Exactive质谱仪平台，部分实验项目使用的是QE-Exactive完成。其中标记定量技术iTRAQ和TMT是依据二级质谱的报告基团离子峰进行定量，而Labe lfree是基于一级质谱峰进行定量。

问题11：蛋白组学实验文章一般发表在哪些期刊上，各有什么区别？ 

答：MCP（molecular & cellular proteomics，影响因子7分左右），JPR(journal of proteome research，影响因子5分左右)，Proteomics（影响因子4分左右），Journal of Prteomics(影响因子4分左右), Electrophoresis(影响因子4分左右), Plos One(影响因子3分左右), 其它的杂志还包括BMC Genomics, Expert Rev Proteomics, BMC Syst Biol, OMICS, Proteomics Clin Appl, Proteome Sci。

问题12：有两个Mix混样，在计算差异表达蛋白时如何使用？

答：计算差异表达蛋白时，将WT组（113、114、115）与Mix1（119）和Mix2（121）的比值取平均值，APO1组（116、117、118）与Mix1（119）和Mix2（121）的比值取平均值，平均值再进行差异筛选。

问题13：生物学重复和技术重复的区别？

答：生物学重复是指不同生物个体或者不同生物群体的样品之间进行地相同处理而进行的实验，而技术重复是指同一样品进行的多次相同实验。举例：对来自三只健康小鼠A、B、C的血清样品分别各进行一次双向电泳，这三次双向电泳就是生物学重复；而取其中一只小鼠的血清样品进行三次双向电泳，或者将三只小鼠的血清混合后的样品进行三次双向电泳，这三次实验就是技术重复。总结生物学重复的样品来自不同的个体或者是群体，重复之间样品不同；而技术重复的几次实验的样品完全相同，可以来自单一个体，也可以是多个个体的混合样品，但用于重复实验的样品完全一样。
 

问题 14：结果报告中怎么没有差异多肽的定量？

答：多肽组质谱数据进行搜库匹配后的结果会进行归一化整理并寻找差异多肽，所以说差异多肽的定量结果是有的，且以Excel发给客户，报告中一般会提及差异多肽的个数，具体的定量信息如果客户有需求也是可以添加的。
 

问题 15：哪些技术需要进行重复实验，以及具体采用生物学重复还是技术重复来完成？

答：Label free需要进行三次重复，而iTRAQ、TMT一般建议客户做3次实验重复，如果实验方案后期设计了大量的验证实验如WB或ELISA等，最好做也能做两次重复；如果不进行重复实验后期的验证实验也少，在后期发表文章的时候结果可能会受到一些审稿人的质疑，从而影响文章的发表，特别是一些高分杂志较为突出，对于立志于发表高水平文章的研究人员建议客户最好进行重复实验设计。如果是进行技术重复，各实验结果之间的数据重复性会更好，而生物学重复由于多种原因可能导致重复性与偏差或者不好，一般情况下Label free最好使用技术重复，这样有利于后续数据的分析，而其他是实验可以采用生物学重复或者技术重复。代谢组根据样品的不同选择合适的数量进行生物学重复。
 

由于问题较多、篇幅较长，今天就暂时先放如上15个问题，剩下的蛋白组学问题我们下期再见。

小鹿话语：大家可以在留言区留下你想咨询的问题哦，说不定下期蛋白组学问题集锦就有您的问题及解答哦~赶紧来get新知识吧！