【小鹿百科】说说植物激素检测那些事！

简 介

     植物激素（plant hormone, PH）是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，以极微量的浓度引发生理效应，在植物生命活动的整个过程中起调控作用。植物基因表达、生长、发育以及植物对某些环境刺激的反应均受其体内多种植物激素的调控。1928 年温特证实了生长素的存在，是首个被证实存在的植物内源激素，随后 1934 年郭葛等人从植物中分离出了生长素。此后，其他植物内源激素陆续被科 学家们发现。传统植物内源激素主要分为五大类，即生长素（IAA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）、 脱落酸（ABA）和乙烯（ET）。而越来越多的研究表明茉莉酸、水杨酸、多胺及油菜素内酯参与植物生长中多种生理过程，包括防御反应，在病原体抗性中发挥活性，因此可以被看作是一类新的植物激素。

　　尽管植物内源激素为简单的小分子有机化合物，它们却有着非常复杂、多样的生理效应， 不仅可以通过调控作物生长发育等过程而直接影响作物产量，也可以通过参与调控作物对各种不利条件和生物胁迫的适应性而减少损失。例如，茉莉酸（JA）和 乙烯（ET）不仅可以协作调控植物的生长，并且能增强 植物对腐生性真菌的耐受性。有研究通过反向遗传学手段，首次证明了乙烯信号通路中的重要转录因子 EIN3/ EIL1 是乙烯与茉莉素的信号交叉节点，并介导部分茉莉素对植物根发育的调控作用。所以通过分子机理的研究，深入认识激素调控植物生长、发育和衰老及其对环境适应的机制，从而为农作物增产增量、品质控制、育种创新提供重要的理论基础，已经成为当今的一个研究热点。

植物激素分类  

1、生 长 素  

     生长素（Auxins）主要由吲哚衍生物构成，具有两个特征结构，一个芳香环（带正电荷）和一个羧基侧链（带负电荷）。内源生长素的主要活性物质包括 IAA 和 IBA。IAA 经过代谢可以转化为 IBA。有研究表明 IBA 可以促进外生根的繁殖，相对于 IAA 其具有较大的生理活性，主要原因是在体外繁殖中发现 IBA 的稳定性比 IAA 强。这两个活性物质和一系列生理过程有关，包括顶端优势、植物的向性、茎的延长、形成层细胞的分裂以及根的萌发。人工合成的生长素如 2,4-D 和萘乙酸在农业生产中得到广泛应用，其作用主要是减少根的发育，提高结实率。

      游离的 IAA 是活性形式的激素，但是在植物体内为了维持 IAA 的自身平衡，绝大多数的生长素却是以共价键结合物的形式存在的，主要包括氧化物、糖的结合物、肌醇和氨基酸。普遍认为 IAA 结合物主要包括两种形式：第一种是以“C-O-C”的链接方式形成，即所谓的“酯链接”，它们主要存在于双子叶或单子叶植物的胚乳中；另外一种是以“C-N-C”的连接方式，即所谓的“酰胺链接”，它们主要存在于双子叶植物或以光营养生长为主的单子叶植物中，其中以天冬氨酸作为IAA 最主要的调节物。这些结合物主要涉及 IAA 的运输和储存，控制活性生长素的含量，并作为种子发育活性生长素的主要来源。

 
2、 赤 霉 素  

     赤霉素类（GAs）属于双萜化合物的酸性植物激素，其基本骨架是赤霉烷，现已鉴定出127种。赤霉素的主要作用是促进种子发、茎秆伸长、细胞分化和开花。赤霉素以 GA12-醛为前体，通过 C-13 先发生羟基化或 C-13 不发生羟基化形成各种赤霉素。各种赤霉素之间的结构非常相似，差异仅在于双键、羧基数目和位置的不同，然而不同种类的赤霉素具有不同的生物活性，在植物生长发育过程中起着很大的作用。其中以 GA1、GA3、GA4、GA7为主要的生物活性物质。

GAs的合成途径

3、 细胞分裂素类

     细胞分裂素（cytokinins,  CTKs）则是一类促进细胞分裂的 PH。第一种植物天然 CTK 是从未成熟的玉米种子中分离出的玉米素（zeatin,  Z）。此后，其他 CTKs 相继被提取和鉴定。

      当前，把具有与激动素（kinetin,  KT）类似生理活性的、天然或人工合成的化合物都称为CTKs。它们均为腺嘌呤的衍生物（结构式见下表），及其与核苷、氨基酸、葡萄糖等形成的结合物。从植物中发现的 CTKs 大多数是 Z 或玉米素核苷，分布于细胞分裂旺盛的部位。在实际农业生产中，应用最广的是人工合成的 KT 和6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine, BA），多用于组培中诱导细胞分化、增加果实结实率、切花保鲜等。

典型细胞分裂素的结构和名称

4、 脱 落 酸  

     60年代初美国人F.T.阿迪科特和英国人P.F.韦尔林分别从脱落的棉花幼果和桦树叶中分离出脱落酸，其分子式为C15H20O4。脱落酸存在于植物的叶、休眠芽、成熟种子中。通常在衰老的器官或组织中的含量比在幼嫩部分中的多。其主要作用抑制细胞分裂，促进叶和果实的衰老和脱落。抑制种子萌发。抑制RNA和蛋白质的合成，从而抑制茎和侧芽生长，因此是一种生长抑制剂，有利于细胞体积增大。与赤霉素有拮抗作用。脱落酸通过促进离层的形成而促进叶柄的脱落，还能促进芽和种子休眠。种子中较高的脱落酸含量是种子休眠的主要原因。经层积处理的桃、红松等种子，芽次之，因其中的脱落酸含量减少而易于萌发。脱落酸也与叶片气孔的开闭有关，小麦叶片干旱时，保卫细胞内脱落酸含量增加，气孔就关闭，从而可减少蒸腾失水。根尖的向重力性运动与脱落酸的分布有关。合成部位：根冠、萎蔫的叶片等。

5、乙 烯   

早在1864年，就有研究发现由照明煤气灯漏出的气体能促进植物落叶。经证实，照明气中的乙烯（ethylene, ETH）可引发豌豆的“三重反应”。在20世纪60年代，ETH被确定为一种植物内源激素。

      ETH 结构非常简单，是一种独特的气态 PH。在高等植物的不同组织、器官和发育时期，ETH 释放量不同，特别在种子萌发、果实成熟时产生量最多。目前，ETH 已大量用于香蕉、番茄等水果在贮运期间的催熟剂。但因其散失过快，不便于农田应用，为此，发展了许多乙烯释放剂，尤以乙烯利为代表。凡 ETH具有的生理效应，如催熟果实、促进脱落、花卉贮存等，均可用乙烯利代替，在实际生产中发挥了广泛的作用。

6、其他天然激素

1、（BR，油菜素内酯）油菜素甾醇类(Brassinosteroids）

促进伸长，延缓叶片衰老，提高抗性，增加产量。

2、多胺

促生长，延缓衰老。

3、茉莉酸，Me-JA

抑制生长，促进衰老。

4、SA（水杨酸）

植物抗病信号转导中抗病基因表达（PRPs）。促进开（雄）花。

植物激素检测难点及优势   

难 点 ：  

1、作为植物次生代谢产物，在植物体内含量极低

      一般鲜样中的含量为 0.1 ～ 50 ng·g － 1（通常在 ng/g，甚至 pg/g 水平上），仅相当于其他类次生代谢产物（如黄酮类）的万分之一；

2、不同样本含量差异大

3、基质复杂，干扰严重

     基质效应由分析物的共流出物影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制作用。基质效应是由于样品基质与被测物在形成气相离子的过程中产生竞争的结果。

共流出干扰物可分为内源性杂质和外源性杂质。内源性组分是指样品提取过程中同时被提取出来的有机或无机分子，包括离子颗粒物成分（电解质、盐类）、强极性化合物（酚类、色素）和各种有机化合物（糖类、胺类、尿素、脂类、肽类及其分析目标物的同类物及其代谢物）。其中磷脂是最主要的内源性组分，而外源性组分主要是由前处理带来，如塑料、有机酸、缓冲盐等。内源性杂质一般与不同的样品基质有关，所以不同的样品，基质效应各不相同。有研究发现，基质效应可能是由于难挥发的化合物或表面积活性大的物质造成，其增加带电小液滴的粘度和表面张力，从而减少目标物达到检测器的离子数量而产生基质效应。基质效应很大程度取决于被分析化合物的性质，极性化合物的离子效率较非极性化合物更容易受到基质共萃取物的影响。

优 势：  

1、超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱(UPLC-ESI-MS/MS)，检测灵敏度高

      UPLC-ESI-MS/MS在多反应离子监测(MRM)模式下分离鉴定植物激素。该技术与气相色谱－质谱联用（GC/MS）技术相比，灵敏度高，选择性好，不需要衍生，前处理简单，化学试剂用量少，可以实现在植物样品的粗提取液中直接进行生理水平植物激素检测。

2、固相萃取提取法能有效减小基质效应

    固相萃取（SPE）是一种结合了选择性保留、选择性洗脱等过程的分离技术。当复杂样品溶液通过吸附剂时，吸附剂会通过极性相互作用、疏水相互作用或离子交换等作用选择性地保留目标化合物和少量与目标化合物性质相近的干扰物，其他组分则透过吸附剂流出小柱然后用另一种洗脱能力更强的溶剂体系选择性地把目标物洗脱下来，从而实现对复杂样品的分离、纯化和富集。

     一般来说，基质效应是由不充分净化引起的，而基质效应可以简单通过减小进样量或稀释样品来解决，但同时也会影响方法的灵敏度而不易采纳。所以改进前处理方法、纯化样品、尽可能地减少最终提取液中的基质成分是最有效、彻底地消除基质效应的方法。

经研究表明固相萃取是最有效的方法，其中混合模式的固相萃取柱，较反相固相萃取柱和离子交换柱更能减少基质共萃取物，基质效应最小。

博苑（鹿明）生物植物激素检测样本要求：

1、 每个样本>500mg；每个处理建议做3次重复；

2、 防止激素降解带来的误差，应保证样品的新鲜度；

3、 标准品如果是粉末状，需提供5mg；若为溶液，则需要2mg/ml的溶液2ml；

4、 若客户要求后续的统计分析，则需要做至少3—5次重复（箱式图则需要至少5次重复）。