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采用生物传感器检测传染病病毒病原体

发布时间: 2020-04-08 11:10 来源:牛津仪器科技(上海)有限公司

近年来,随着SARS、MERS和Covid-19等传染性疾病的区域性甚至全球性爆发引起了人们对于流行性病毒的关注,科学研究者们需要追求更加快速检测病毒的手段,生物传感器作为一种关键技术为快速检测提供了一个很好的方法。从受污染的食物或水,患者样本中或表面快速鉴定病毒是否存在,是有效抵抗病毒暴发、流行病和生物恐怖主义的前提。

目前,对病毒检测高灵敏度的是依靠聚合酶链反应(PCR)进行病毒DNA和RNA的增殖和检测分析。然而,这种技术处理时间长(通常为24小时),缺乏实时监测和快速现场病原体检测,而且还需要先进的实验室设备和训练有素的人员。


人类诺如病毒(NoV)的生物分析测定

瑞典查尔默斯理工大学(Chalmers University of Technology)的弗雷德里克·胡克(Fredrik Höök)领导的研究小组开发了一种生物分析方法,用于检测病毒颗粒,检测灵敏度达到单个病毒颗粒水平。在他们近期的工作中,他们的重点是检测人类诺如病毒(NoV);一种极具传染性的病毒,可引起肠胃炎或俗称的“冬季呕吐病”。

在这项研究中,将较为常见的诺如病毒II.4基因组(Ast/6139/01 strain)的病毒样颗粒(VLPs)作为病原体模型。诺如病毒是人类杯状病毒家族中的一种小型无包膜RNA病毒,具有高度的遗传多样性。它包括180个衣壳蛋白组装而成的二十面体外壳,用来保护病毒基因组。


冬季呕吐病”

这种病毒引起的“冬季呕吐病”已成为全球传播的流行病。尽管它没有MERS或SARS等大流行病的影响力,但其每年会造成20多万人死亡,其中主要是发展中国家的儿童。这种非常稳定、传染性极强的诺如病毒通过粪-口途径传播,一般在食用受污染的食物或水后会引起爆发。由于极低的颗粒数(<100)足以引起疾病爆发,因此对其进行早期监测非常重要且具有挑战性。

昆虫细胞中重组表达的自组装衣壳蛋白常被用来探测病毒的结合行为。这些非感染性病毒样蛋白(VLP)表现出与真实病毒相似的形态和结合特性,并能高度特异性地识别多种唾液和细胞表面糖复合物,包括膜结合的组织血型活性鞘糖脂(GSL)。这些VLP为设计用于病毒检测的新型生物传感器原理提供了很好的模型。


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图1. 三明治实验装置的示意图。将颗粒捕获到包含10%的H型I鞘糖脂(GSL)的双分子层中,以高特异性识别VLP。囊泡由5%H型1GSL的传感器结合罗丹明标记,通过TIRF照明产生荧光信号。


这项研究的测定方法是基于三明治型结构,其中VLP首先被捕获到含有NoV特异性GSL配体的非污染(蛋白质的低非特异性吸附)支持的脂质双分子层上。然后,通过对包含相同NoV特异性配体的单个荧光标记的磷脂囊泡进行成像,获得牢固结合的VLP的图像(图1)。利用TIRF照射产生的隐失波来区分表面结合的囊泡与溶液中的囊泡,可以确定并跟踪传感器界面的囊泡结合和释放事件。因此,这种设置不仅可以对单个病毒颗粒进行成像,还可以获得它们与受体(本例中为GSL)间亲和力的信息。[1]

使用TIRF显微镜和iXon EMCCD相机,以每秒5帧的速度采集了1000帧的时间序列视频。该测定法在96孔板中进行,所有感兴趣的孔拍摄7个不同的视野,以确保统计数据的可重复性。基于MatLab的软件用于分析图像。简而言之,如果荧光标记的囊泡的强度超过预设阈值,并且存在于预定数量的连续帧(最少7帧)中,则对此囊泡进行计数。通过记录随时间变化新到达的囊泡的数量以及测量囊泡的停留时间来生成关联图,同时定量测定了该方法的检测限。

这项研究的结果表明,Höök博士及其同事开发的用于检测诺如病毒的生物传感器具有良好的特异性,几乎没有非特异性结合(图2)。该方法表现出单分子级别的灵敏度,因为可以很容易地对单个囊泡进行成像。囊泡产生局部信号,该信号可以很容易地从背景噪声中分辨出来。尽管可以有效地抑制背景噪声,但影响检测限(LOD)的关键因素是由非特异性结合事件产生的背景信号。需要考虑的一个重要方面是传感器界面的封闭特性,该特性应该是不结合病毒和囊泡的。在这项研究中使用的脂质双分子层满足这些条件。另外,作者展示了如何根据囊泡在界面上的停留时间,利用囊泡结合事件的实时监测来区分特定形式的非特异性结合,从而进一步降低非特异性背景信号。


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图2. 由12.5 pM VLP培养的双分子层膜上的表面结合囊泡的代表性显微镜图像(左图),以及无VLP的情况下进行的阴性对照(右图)。


研究小组已经证明,结合单分子灵敏度和平衡波动分析是一种相对简单的检测装置,可用于检测LOD约为106粒/ml的病毒颗粒。该LOD优于大多数在生物传感器方面用于检测诺如病毒的其他报道,并且整个检测可以在不到两个小时内完成,这是对目前较为敏感的病毒检测方法(使用PCR)的重大改进。此外,这些技术可以扩展到其他病毒病原体的研究。


相关文献:

[1] Bally, M., Gunnarsson, A.; Svensson, L.; Larson, G. Zhdanov; V. P.; Höök, F., Interaction of Single Virus-like Particles with Vesicles Containing Glycosphingolipids. Physical Review Letters, 107 (18) pp. 188103.


iXon EMCCD Life是TIRF显微镜的理想相机。新款iXon 888型号是Andor目前速度超快的EMCCD探测器,读取速度为93 fps(512 x 512),以及26 fps( 完整1024 x 1024)。使用用户定义的子阵列可以进一步加速,例如128 x128子阵列,读取速度超过600 fps,同时始终保持单光子灵敏度和定量稳定性。该模型还保留了“最高灵敏度”的状态,热电制冷至-80°C,超低的时钟诱导电荷噪声。iXon的其他功能包括USB连接,iXon Ultra型号还提供直接原始数据访问,以进行实时处理,EMCCD和传统的CCD读出模式提供了更高的应用灵活性,并在CCD模式下具有新的“低速和慢速”噪声性能。


标签:生物传感器,传染病,病毒,病原体,检测
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